★ 李威 楊鳳云

（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

KOA 是臨床常見退行性關(guān)節(jié)病，發(fā)病機(jī)制暫不明確，由多種不確定因素所致的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等［1］。多發(fā)于中老年人，我國65 歲老年人KOA 患病率達(dá)8.1%，且呈上升趨勢［2-3］。為探尋其病因及發(fā)病機(jī)理，近年來大量的科研人員通過手術(shù)造模、膝關(guān)節(jié)制動(dòng)造模、關(guān)節(jié)腔注射藥物造模等多種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取得了不錯(cuò)的成績，現(xiàn)對其研究現(xiàn)狀作如下闡述。

膝骨性關(guān)節(jié)炎模型常采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為鼠和兔，而鼠類關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)與人類較接近， 骨性關(guān)節(jié)炎模型軟骨生化指標(biāo)與人類患此病的情況相對較一致；在形態(tài)學(xué)方面，鼠類軟骨細(xì)胞凋亡方式與人類軟骨細(xì)胞凋亡方式相類似；同時(shí)鼠類具有易飼養(yǎng)、體積小、價(jià)廉的特點(diǎn)，故臨床上常用鼠類制備膝骨性關(guān)節(jié)炎模型［4］。膝骨性關(guān)節(jié)炎模型的建立大體可分為兩大類：一為自發(fā)性模型，即無人為干預(yù)、自發(fā)進(jìn)行的過程，無需借助外力；另一類為干預(yù)誘發(fā)性模型：即通過人為的各種方法干預(yù)后誘導(dǎo)發(fā)生，需要借助外力。

1 自發(fā)性造模

與人類一樣，由于運(yùn)動(dòng)磨損，年老退化等原因鼠類也會(huì)罹患膝骨性關(guān)節(jié)炎；Silberberg 等［5］學(xué)者通過對黑鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)研究，首次發(fā)現(xiàn)黑鼠關(guān)節(jié)軟骨退變與人類相似，在無人為干預(yù)的情況下，黑鼠會(huì)自發(fā)的患膝骨性關(guān)節(jié)炎。而目前最常用的自發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎模型是hartly 豚鼠的膝關(guān)節(jié)［6］，因?yàn)樾坌詇artly 豚鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎病變方式與人類的相似，主要以負(fù)重區(qū)發(fā)生軟組織改變，便于實(shí)驗(yàn)與研究。此方法缺點(diǎn)是時(shí)間長、造模慢、不好控制；優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、無需人工干預(yù)。

2 干預(yù)誘發(fā)性造模

2.1 膝關(guān)節(jié)制動(dòng)造模肢體的制動(dòng)在臨床上常用于軟組織或骨折等創(chuàng)傷的治療手段，然而肢體制動(dòng)也會(huì)造成新的損傷。膝關(guān)節(jié)制動(dòng)造模是指將鼠類膝關(guān)節(jié)長時(shí)間固定幾周以上或短期的反復(fù)制動(dòng)，通過限制關(guān)節(jié)活動(dòng)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性改變；多采用過曲位和過伸位固定［7］，都可以取得不錯(cuò)的造模效果。錢潔等［8］用石膏繃帶將棉脂墊固定于大鼠左側(cè)踝與髖關(guān)節(jié)之間，固定于過伸位；3 周后開始出現(xiàn)膝骨性關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)，成功建立KOA 模型。QIN J 等［9］通過固定Wistar 大鼠雙前肢及尾部來建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，控制關(guān)節(jié)的活動(dòng)，6 周后由于用進(jìn)廢退導(dǎo)致關(guān)節(jié)退行性變化明顯，關(guān)節(jié)軟骨退化變硬，關(guān)節(jié)間隙變窄、僵硬、活動(dòng)受限，也是一種模型建立的方法。

但此方法操作難度大，效果難以掌控，可重復(fù)性較低，關(guān)節(jié)制動(dòng)需時(shí)刻觀察以防止制動(dòng)工具松動(dòng)或脫落，影響造模效果。

2.2 喂養(yǎng)造模Silberberg 等［10］通過給C57BL 小鼠喂養(yǎng)含高脂肪、高動(dòng)物油脂的飼料，發(fā)現(xiàn)會(huì)增加其膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，而且患關(guān)節(jié)炎的幾率與高脂肪飼料的用量有關(guān)。何建宜等［11］通過對C57BL/6J 雄鼠進(jìn)行分組喂養(yǎng)，空白組用普通維持飼料，對照組用高脂飼料，16 周后對其行HE 及番紅O 染色染色處理，發(fā)現(xiàn)高脂組軟骨關(guān)節(jié)面不完整，軟骨細(xì)胞量減少。而且用Omega-3 脂肪酸代替必需脂肪酸Omega-6 會(huì)加速關(guān)節(jié)軟骨纖維改變。

喂養(yǎng)造模較少見，造模效果不明顯，不可控因素太多，難以達(dá)到較好的效果。

2.3 關(guān)節(jié)腔注射藥物造模

2.3.1 碘乙酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉造模是一種較常用的造模方法。其作用機(jī)理是：碘乙酸鈉是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的抑制劑，注射后會(huì)使軟骨基質(zhì)發(fā)生改變、軟骨發(fā)生降解和丟失，出現(xiàn)滑膜炎等癥狀，與人類產(chǎn)生的病變較為相似［12］。Hagmann 和Noriko 等［13-15］對雄性Wistar 大鼠的膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸鈉，4 周后病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重、變性，有局部炎癥灶點(diǎn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有游離體形成，骨礦物質(zhì)密度測量提示礦物質(zhì)含量低于正常水平，以此建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。張文強(qiáng)等［16］通過將0.1mL 4%碘乙酸鈉溶液50μL 注射到鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，觀察大鼠關(guān)節(jié)液內(nèi)miR-34a 的量的表達(dá)情況（miR-34a 有抑制軟骨細(xì)胞生長的作用），8 周后分離軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用細(xì)胞流式儀檢測發(fā)現(xiàn)miR-34a 在軟骨細(xì)胞中的含量明顯增高。

此造模方法優(yōu)點(diǎn)在于模型建立時(shí)間短，操作簡便，易于控制，關(guān)節(jié)穩(wěn)定，模型較為典型，實(shí)用性強(qiáng)。

2.3.2 膠原酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射膠原酶也是經(jīng)典的造模方法。其機(jī)理是：膠原酶能分解細(xì)胞間基質(zhì)的膠原蛋白，從而分解關(guān)節(jié)軟骨、半月板及其他關(guān)節(jié)組織的膠原蛋白，從而破壞關(guān)節(jié)而達(dá)到膝關(guān)節(jié)炎的病理變化。梁霄等［17］通過分別在第1、3d 將10μL 含量1 或2 U 的膠原酶注射在遠(yuǎn)交系雄性小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，4 周后病理觀察后發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)有明顯退變的痕跡，滑膜和關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生不同程度的硬化和破壞，并且軟骨的退變逐漸加重，可以形成不錯(cuò)的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型；并且發(fā)現(xiàn)膠原酶的濃度差異也可以建立不同程度的模型，模型都會(huì)形成，只是效果會(huì)有所差異，可根據(jù)需要選擇濃度。

膠原酶造?？梢院芎玫挠^察關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程，特異性強(qiáng)，對關(guān)節(jié)軟骨識(shí)別靈敏，有其特殊的優(yōu)越性，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

2.3.3 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶注射也是科研實(shí)驗(yàn)中模型建立主要的方法之一。其原理是：木瓜蛋白酶能降解軟骨內(nèi)的蛋白多糖，降低了對軟骨的保護(hù)作用。同時(shí)分解的多糖殘留進(jìn)入關(guān)節(jié)內(nèi)，會(huì)刺激關(guān)節(jié)而引發(fā)炎癥。段文秀等［18］學(xué)者通過用4%木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液對大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行注射，造模后分別用透射電鏡觀察第1，2，4，6 周股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨超細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化。觀察到股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨隨著時(shí)間的推移而變化明顯，軟骨破壞不斷加重，其中造模后4 周左右改變最為明顯，滑膜明顯增生變性，關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化。

該造模方案會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜增生等典型的膝骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，而且此造模方法簡單，周期較短，重復(fù)性高，關(guān)節(jié)穩(wěn)定性好。

2.3.4 其他造模方法關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射造模方法還有很多，越來越多的方法出現(xiàn)，來源于科研學(xué)者們對實(shí)驗(yàn)的執(zhí)著與熱愛，使得造模方法不斷地在發(fā)展與更新。其他主要方法還有聚乙烯亞胺（polyethyleneimine）、雌二醇（estradiol）、菲律賓菌素（filipin）尿激酶型纖溶酶原激活物（urinary plasminogen activator，uPA）、軟骨碎片或微粒、透明質(zhì)酸酶、單體碘乙酸腎上腺皮質(zhì)激素、乙烯亞胺多聚物、異物等關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射都可以建立KOA 模型［19-21］。

關(guān)節(jié)腔注射造模方法匯總?cè)绫?。

表1 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射造模表

2.4 手術(shù)造模目前科學(xué)實(shí)驗(yàn)中采用手術(shù)方法建立模型發(fā)展迅速，應(yīng)用廣泛，其機(jī)理主要是破壞關(guān)節(jié)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定，使關(guān)節(jié)受力不均，失去原有的平衡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)的磨損從而誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的改變，形成關(guān)節(jié)炎。

如：Hulth 手術(shù)造模［22］，Hulth 法是較早出現(xiàn)的手術(shù)造模方法，而且也是手術(shù)建立模型較常用的方法。Stoop R等［23］通過打開關(guān)節(jié)腔，離斷內(nèi)側(cè)副韌帶，內(nèi)側(cè)半月板并切斷前交叉韌帶的手術(shù)方法，觀察5 周后關(guān)節(jié)變化，得到KOA 模型。改良Hulth 法：李文雄等［24］選擇從大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開并打開關(guān)節(jié)腔，離斷內(nèi)側(cè)副韌帶，再離斷前后交叉韌帶，最后把內(nèi)側(cè)半月板全部摘除，造模1 周后，每日驅(qū)趕大鼠活動(dòng)30min 以上，并持續(xù)8 周，得到KOA 模型。孫先潤等［25］通過切斷大鼠前交叉韌帶建立KOA 模型，并于術(shù)后觀察其病理變化及特征，成功觀察到關(guān)節(jié)炎的病理變化。陳蔚東等［26］通過在SD 大鼠膝髕旁內(nèi)側(cè)切開，直到關(guān)節(jié)腔，并把髕骨向外側(cè)推使之脫位，使膝關(guān)節(jié)處于最大屈曲位置，暴露關(guān)節(jié)腔，并剪掉內(nèi)側(cè)半月板的1/3和前交叉韌帶，成功建立KOA 模型。張榮凱等和Hayami T 等［27-29］通過“內(nèi)側(cè)副韌帶切斷+內(nèi)側(cè)半月板切除”的方法，術(shù)后4 周觀察其病理、形態(tài)學(xué)等方面發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)股骨髁均見明顯的軟骨面輕度糜爛，少部分關(guān)節(jié)潰瘍磨損，外側(cè)股骨髁軟骨面稍粗糙，外側(cè)脛骨平臺(tái)光滑如常，發(fā)生的變化與人類早期關(guān)節(jié)炎較為相似，而且干預(yù)時(shí)間較短，成功的幾率高。Ochiai 等［30］通過將雄性SD 大鼠的前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶離斷的方法，4 周后打開關(guān)節(jié)腔觀察發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)退化嚴(yán)重，韌帶明顯縮短，炎癥明顯且修復(fù)較快，纖維組織增生明顯變硬，此實(shí)驗(yàn)方法也可得到KOA 模型。

手術(shù)方法建立模型時(shí)間短，效果好，經(jīng)濟(jì)且能較好模擬出關(guān)節(jié)炎的病理變化過程。但操作復(fù)雜，不好控制，且造模后關(guān)節(jié)不穩(wěn)定影響關(guān)節(jié)基本活動(dòng)，有一定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的可以優(yōu)先選擇此方法。

3 討論

目前科研實(shí)驗(yàn)中對于使用鼠類建立KOA 模型的方法及技術(shù)相對成熟。但現(xiàn)階段科研與臨床的結(jié)合度還不是特別高，臨床上對于關(guān)節(jié)炎的了解還不夠深入，膝骨性關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機(jī)制還不明確，需要人們不斷地挖掘與創(chuàng)新。同時(shí)，大量實(shí)驗(yàn)的探究使得這項(xiàng)技術(shù)不斷發(fā)展與完善，越來越多模型建立方法出現(xiàn)，卻出現(xiàn)一個(gè)新的問題，在各式各樣的方案面前，難以選擇合適的方案。模型建立是否成功或者成功需達(dá)到的水平都沒有一個(gè)評定的標(biāo)準(zhǔn)，建立一個(gè)合理的標(biāo)準(zhǔn)非常有必要；其次，把科研與臨床相結(jié)合迫在眉睫，目前現(xiàn)狀是臨床大多數(shù)醫(yī)生沒有接觸過科研，而科研人員又常常與臨床脫節(jié)，很難實(shí)現(xiàn)臨床與科研步調(diào)統(tǒng)一，導(dǎo)致科研結(jié)果不能在短時(shí)間內(nèi)使臨床病人受益。

總之，各種造模方法大致的原理是類似的：都是模擬人類KOA 的發(fā)病機(jī)理、力學(xué)的改變、局部病理變化、關(guān)節(jié)軟骨的病變過程等［31］。同時(shí)，不同的模型建立方法均有其獨(dú)特之處，均有其不同的優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件。所以，在實(shí)驗(yàn)中需依照實(shí)際情況（如實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)費(fèi)等）來選擇自己適用的建立方法，需盡量選擇一些與人類KOA 發(fā)病機(jī)理相似的建立方法，得到的模型更加符合疾病的病變過程，更加接近人體內(nèi)部動(dòng)態(tài)變化，從而更好的了解疾病，理解其病因和發(fā)病機(jī)制，完善臨床上的防治方法，達(dá)到實(shí)驗(yàn)輔助臨床的目的［32］。