李旖梅，王召軍，閆筱筱，張洪映，李雪君，孫計平，黃明月，崔紅*

1 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002；

2 河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000；

3 四川中煙工業(yè)有限責任公司長城雪茄廠，四川省德陽市什邡市鎣華山路南段128號 618400

煙草葉面化學成分豐富，主要由二萜化合物、蔗糖酯、蠟質(zhì)、微元素、揮發(fā)性化合物等構(gòu)成[1]。其中，二萜化合物和蔗糖酯在葉面腺毛中特異地合成，作為腺毛分泌物構(gòu)成了葉面化學成分的主要部分[2]。煙草二萜化合物由西柏烷類化合物和賴百當類化合物組成，作為重要的香氣前體物，二者對煙葉香氣品質(zhì)具有不同的影響[3]。西柏三烯二醇是主要的西柏烷類化合物，其降解產(chǎn)物茄酮具有青香、草香及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等具有甜香和酮香等特殊的香味；順冷杉醇、賴百當二醇是主要的賴百當類化合物，其降解產(chǎn)物降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯、脫氫龍涎香內(nèi)酯等都具有強烈的龍涎香香氣[3]。西柏烷類和賴百當類化合物在不同煙草類型之間的分布也不相同。西柏烷類化合物在烤煙、白肋煙、雪茄煙、香料煙中廣泛存在，但在烤煙中含量最高；賴百當類化合物則主要存在于香料煙和雪茄煙中，烤煙中基本不含有賴百當類化合物[4]。二萜化合物的不同特性及其在不同煙草類型之間的顯著差異，表明其與煙草的香氣風格密切相關。

8306 是以葉面化學成分為目標選育出來的烤煙品系，其葉面腺毛分泌物含量遠遠高于K326、云煙87 等烤煙品種[5]。以其為父本與K326 雜交選育出來的雜交種“豫煙11”具有高分泌、高香氣的特點[6]。但其香氣風格具有晾曬煙的特征，在一定程度上影響了其工業(yè)可用性。李艷華[7]等對我國主要烤煙品種葉面化學成分的比較分析表明，紅花大金元、中煙100、翠碧1 號和K326 等品種的二萜化合物主要是西柏烷二萜，包括α，β-西柏烷三烯一醇和α，β-西柏烷三烯二醇，唯有在豫煙11 中檢測到了順冷杉醇和賴百當二醇的存在；進一步對二萜化合物合成關鍵基因的表達分析證明，煙草柯巴基焦磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase 2，NtCPS2），僅在豫煙11 中呈現(xiàn)出高表達，而在其余4 個烤煙品種中的表達水平極低。由此推測，NtCPS2 基因的高表達是導致豫煙11中賴百當類化合物的合成及晾曬煙風格產(chǎn)生的關鍵，而該性狀主要來源于其父本8306，與其母本K326無關。

NtCPS2 是煙草賴百當二萜合成的關鍵酶，它催化焦磷酸香葉基香葉酯（geranylgeranyl-PP，GGPP）形成8-羥基-古巴內(nèi)脂焦磷酸（8-α-hydroxy-copalylpyrophophate，簡稱8-OH-CPP），在NtABS 的催化作用下，生成順冷杉醇和賴百當二醇[8]（如圖1）。

圖1 煙草二萜合成途徑Fig. 1 The biosynthetic pathway of tobacco diterpenes

8306 作為重要的高分泌型烤煙育種材料，阻斷其賴百當類化合物的生物合成，定向改良其葉面化學成分，對烤煙高香氣育種具有重要意義。因此，本研究采用基因編輯技術敲除8306 中的NtCPS2 基因，對獲得的NtCPS2 基因純合突變材料進行了農(nóng)藝性狀、葉面化學和基因表達等檢測分析，為豫煙11 的香氣品質(zhì)改良及高香氣烤煙選育奠定了基礎。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料煙草8306 種子，經(jīng)無菌水、75%酒精和次氯酸鈉消毒后，在組培瓶中萌發(fā)成苗。無菌苗培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%，光照條件為16 h 光/8 h 暗。

1.2 試驗方法

1.2.1 NtCPS2 敲除載體的構(gòu)建和菌株轉(zhuǎn)化

根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站（https://solgenomics.net/）已發(fā)表的煙草NtCPS2基因序列（Nitab4.5_0001630g0010.1、Nitab4.5_ 0006403g0010.1）， 利 用 CRISPR2 在 線軟 件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/） 設 計gRNA 序列，選擇位于308 bp 至329 bp 之間的序列5’-TGTTGAATTCGATGGAGGATGG-3’為靶標序列，人工合成Oligo 二聚體與CRISPR/Ca9 敲除載體[9]進行連接。反應體系如下：CRISPR/Ca9 載體2.0 μL，Oligo 二 聚 體 1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL， 無 菌 水H2O 補充至 10.0 μL。凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于含有卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，挑取白斑進行菌液PCR 抗性檢測。提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105 中，用于共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定

采用葉盤法[10]轉(zhuǎn)化煙草8306。取農(nóng)桿菌EHA105 菌液侵染葉圓片，在MS 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48 h 后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS+NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+Hyg 8 mg/L+Cef 500 mg/L) 上 進行培養(yǎng)，待芽長至2 cm 時剪下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+NAA 0.10 mg/L+Hyg 8 mg/L） 中 生 根 成苗。提取抗性苗葉片DNA，利用NtCPS2 特異引物（F1:GTTAAATGAAATCATAGCGGAATTG；R1:ACACGTCTTACTT GTGATAATGTT）進行PCR擴增，回收擴增產(chǎn)物（萊楓生物試劑盒），由金唯智公司進行序列測定。

陽性植株自交收種，漂浮育苗至三葉一心，采用CTAB法提取T1代單株葉片的DNA，利用潮霉素抗性基因特異引 物（F2：CGAGAGCCTGACCTATTG CAT，R2 ：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC）進行PCR擴增，對T1代單株進行分子鑒定，篩選出無潮霉素抗性基因的單株自交留種，用于田間試驗和性狀分析。

1.2.3 RT-PCR 分析

分別選取8306 和8306-1 的5 cm 長的幼嫩葉片，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以煙草L25 核糖體蛋白（L18908）為內(nèi)參基因，采用半定量PCR 技 術， 對 NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1、NtGPPS、NtGGPPS、NtCPS2、NtABS、NtCYC 和 NtCYP71D16 等基因的表達水平進行比較分析。引物序列設計如下表所示：

表1 擴增引物序列Tab. 1 Amplification of primer sequences

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

8306 及其NtCPS2 基因敲除純合去載體的株系8306-1 進行漂浮育苗，于2019 年5 月5 日移栽至河南省農(nóng)科院煙草研究所試驗田。按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進行大田管理，并在現(xiàn)蕾期進行農(nóng)藝性狀指標的測量[11]。

1.2.5 腺毛形態(tài)學觀察及密度統(tǒng)計分析

選取長10 cm 左右的幼葉，從葉尖向葉基數(shù)第四脈和第五脈間之間取樣，葉片腺毛組織化學染色法參考 Lin 和 Wagner 的方法[12]。將葉片在 0.2%（w/v）羅丹明B 水溶液中浸染30 min，用蒸餾水漂洗三次，使用無菌濾紙吸干表面水分后，利用超景深顯微鏡（基恩士VHR-5000，日本）對葉片表面進行觀察，并在上表皮中部隨機選擇3 個視野進行腺毛形態(tài)拍照和腺毛密度統(tǒng)計分析。

1.2.6 葉面化學成分分析

取葉齡為60 天的中部煙葉（10～12 葉位）進行葉面分泌物的提取。樣品的制備及前處理參考韓錦峰等[13]的葉圓片法。在二氯甲烷溶液中浸提，浸提液加入1 mL 內(nèi)標（2.020 mg/mL 的蔗糖八乙酸酯和 2.542 mg/mL 的正十七烷醇的混合溶液）后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后，在氮氣保護下將溶劑吹干。加入500 μL 1 :1（V : V）DMF : BSTFA，75℃水浴中進行衍生化反應60 min，然后加入N,O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL。采取GC/MS 分析儀（美國Agilent 公司，色譜儀型號HP-5890，質(zhì)譜儀型號vc-70SE）進行樣品化學成分的定性和定量分析，色譜參數(shù)檢測參考王霄龍等[14]的方法,采用內(nèi)標定量法（相對校正因子為1）進行定量分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)使用EXCEL 進行整理，使用SPSS17.0軟件（IBM，美國）進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)處理采用單因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草8306 NtCPS2 基因突變體的創(chuàng)制和分析

構(gòu)建NtCPS2 敲除載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，并對8306 葉片進行侵染，在含有潮霉素（8 mg/L）的篩選培養(yǎng)基上進行分化。利用NtCPS2 基因特異引物對潮霉素抗性植株進行PCR 擴增和產(chǎn)物測序。在所檢測的42 株抗性苗中，有19 株在gRNA 區(qū)域出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，基因編輯效率接近45.2%。其中，編號為C13 的植株在第324 位置插入A，發(fā)生了單堿基插入的純合突變（圖2），致使翻譯提前終止，NtCPS2基因表達蛋白合成受阻。自交收種后對T1 代進行潮霉素基因檢測，篩選NtCPS2 基因發(fā)生純合突變且無轉(zhuǎn)基因元件的株系，自交收種，并命名為8306-1。

圖2 8306NtCPS2 基因敲除植株gRNA 序列分析Fig. 2 gRNA sequencing analysis of 8306 plant with NtCPS2 gene knockout

2.2 NtCPS2 基因突變對煙株農(nóng)藝性狀的影響

為比較NtCPS2 基因敲除對煙株生長發(fā)育的影響，將8306 和8306-1（T2 代）在河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所試驗田進行種植。田間觀察發(fā)現(xiàn)，在整個生育期中，8306-1 與8306 的生長發(fā)育狀況基本一致（如圖3）。在現(xiàn)蕾期對各項農(nóng)藝性狀指標進行了調(diào)查，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯旮?、莖圍、節(jié)距、最大葉長、最大葉寬和有效葉數(shù)上，8306-1 和8306 之間并無差異。

2.3 NtCPS2 基因敲除對腺毛發(fā)育的影響觀察

在煙株幼苗期分別對8306 和8306-1 幼葉進行葉面腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計，結(jié)果如圖4?？梢钥闯觯?306-1 與對照8306 的葉面腺毛均由長柄分泌型、短柄分泌型和非分泌型3 種類型組成，且均以長柄分泌型為主；長柄腺毛分泌旺盛，其分泌物能被羅丹明染成紅色。對腺毛密度的統(tǒng)計結(jié)果可以看出，8306-1 與對照8306 相比，無論是腺毛總量還是腺毛不同類型，腺毛密度都沒有顯著差異，說明NtCPS2 基因的表達對煙草腺毛發(fā)生并無影響。

圖3 田間植株形態(tài)觀察Fig. 3 Plant Morphology Observation of 8306 and 8306-1 in Field

表2 8306 和8306-1 農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果Tab. 2 Comparison of agronomic traits between 8306 and 8306-1

圖4 8306 和8306-1 腺毛形態(tài)及腺毛密度Fig. 4 Comparison of trichome morphology and density between 8306 and 8306-1

2.4 NtCPS2 基因突變對煙草葉面化學成分的影響

對葉齡為60 天的中部葉片進行葉面化學成分萃取和GC/MS 檢測分析，結(jié)果如圖5 所示。從質(zhì)譜圖可以看出，NtCPS2 基因突變對葉面化學組成成分產(chǎn)生了明顯影響：8306 的主要葉面化學成分為α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇、順冷杉醇、賴百當二醇和蔗糖酯，而8306-1 主要化學成分為α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇和糖酯，保留時間為42.89 min 的順冷杉醇峰和保留時間為54.23 min的賴百當二醇峰明顯缺失，說明其不含賴百當類二萜。從含量上看，8306-1 和8306 相比，西柏烷類二萜、蔗糖酯及葉面化學成分總含量均沒有顯著差異，而賴白當類二萜則呈極顯著差異，可見，NtCPS2 基因突變可以有效抑制賴百當類二萜的生物合成，對其它葉面化學成分無明顯影響。

圖5 8306 與8306-1 葉面化學成分檢測分析Fig. 5 Detection and analysis of leaf surface chemical components between 8306 and 8306-1

2.5 NtCPS2 基因突變對煙草二萜代謝相關基因表達的影響

為闡明NtCPS2 基因突變對煙草萜類代謝的影響，采用RT-PCR 技術對二萜代謝及MEP 途徑關鍵基因的表達水平進行了檢測分析。從圖6 可以看出，在8306 與8306-1 中，類萜前體物質(zhì)IPP 及DMAPP生物合成的MEP 途徑中的關鍵酶基因NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1的表達水平基本一致，煙草二萜合成關鍵基因NtCPS2、NtABS、NtCYC、NtCYP71D16 及其上游基因NtGPPS、NtGGPPS 的表達，在轉(zhuǎn)錄水平上亦無明顯差異。這說明NtCPS2 基因突變并不影響煙草類萜合成相關基因的表達，除了賴百當化合物合成受阻之外，其它萜類代謝流向穩(wěn)定。這與葉面化學成分的檢測結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論與討論

煙草二萜化合物在煙草長柄腺毛中特異合成并向葉表面分泌，構(gòu)成了煙草葉面化學的主要成分。目前已知的煙草二萜化合物主要包括西柏烷和賴百當兩大類，二者在不同類型煙草間的分布不同[15]，是其煙葉香氣風格特征形成的原因之一。烤煙中二萜化合物以西柏烷類為主，大多數(shù)主栽品種中不含賴百當化合物，但在豫煙11 中檢測到了順冷杉醇和賴百當二醇的存在，推測這是導致該品種具有“特香型風味”的主要原因[7]。由于豫煙11 是由8306 和K326 雜交而成，而K326 本身不含有賴百當二萜，因此對8306 葉面化學的改良是恢復豫煙11 典型烤煙風格的關鍵。同時，作為重要的高香氣育種材料，8306 葉面化學成分的定向改良對高香氣烤煙育種也具有重要意義。

圖6 二萜合成途徑及半定量PCR 分析Fig. 6 Semi-quantitative PCR analysis of terpene synthesis genes between 8306 and 8306-1

NtCPS2 是煙草賴百當二萜合成的關鍵酶基因。Sallaud[8]等研究發(fā)現(xiàn)，烤煙中NtCPS2 基因第4 外顯子的堿基突變導致翻譯提前終止，是烤煙中賴百當二萜合成受阻的根本原因。本研究利用CRISPR/ CAS9技術對NtCPS2 基因進行編輯，其純合突變株系8306-1 腺毛發(fā)育正常，但葉面化學成分中順冷杉醇和賴百當二醇明顯缺失，這與Sallaud 等人的研究結(jié)果相符，證明NtCPS2 是調(diào)控煙草賴百當二萜生物合成的關鍵基因?？紤]到西柏烷二萜和賴百當二萜具有相同的底物GGPP，賴百當合成受阻理論上應該會引起西柏烷二萜含量的提高，但本研究結(jié)果顯示8306-1中西柏烷二萜、蔗糖酯含量及葉面化學總量與對照相比并無顯著變化。這可能是由于烤煙中賴百當二萜的含量遠遠低于西柏烷二萜，抑制其合成對西柏烷二萜合成不會造成明顯影響。RT-PCR 分析結(jié)果顯示8306與8306-1 中IPP 及二萜合成相關基因的表達水平基本不變，這也證明了NtCPS2 基因突變除了抑制賴百當二萜合成之外，對煙草類萜整體代謝流向影響不大，加之NtCPS2 基因突變后煙株生長發(fā)育和農(nóng)藝性狀正常，因此認為該基因是進行煙草葉面化學成分定向改良的理想靶點。

煙草8306 是河南農(nóng)業(yè)大學楊鐵釗課題組以腺毛分泌物為目標選育出的育種材料，在烤煙高香氣育種中發(fā)揮重要作用。通過NtCPS2 基因突變來抑制8306中賴百當二萜的生物合成，有利于彰顯典型的烤煙香氣風格、擴大其在高香氣烤煙育種中應用范圍。另外，在對8306 葉面化學成分進行定向改良的基礎上還可以對其腺毛密度進行分子改良，進一步提高西柏烷二萜和蔗糖酯等腺毛分泌物的含量，創(chuàng)制高分泌型育種材料，為高香氣烤煙育種奠定基礎。