狄昌穎 張 萌 楊曉理

作者單位：云南富民諾維生物科技有限公司 650000

神經(jīng)酸(Nervonic Acid)，化學名順-15-二十四碳烯酸(Cis-15-Tetracosenic Acid)，別名鯊油酸(Selacholeic Acid)，是一種單不飽和脂肪酸。神經(jīng)酸在神經(jīng)組織和腦中含量較高，是組成生物膜的重要物質(zhì)，是腦甙中髓質(zhì)的標志物。大腦終生都需要一些特殊的營養(yǎng)成分，神經(jīng)酸是神經(jīng)細胞(特別是大腦細胞、視神經(jīng)細胞、周圍神經(jīng))生長、再發(fā)育和維持必需的“高級營養(yǎng)素”。[1]由于人體自身很難合成，體外攝取顯得尤為重要。

根據(jù)加拿大圭爾夫大學(University of Guelph)人類生物科學營養(yǎng)科學研究所的威廉·貝格博士(William J.Bettger，PhD)研究表明，神經(jīng)酸在歐美發(fā)達國家的主要用途為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝內(nèi)分泌疾病的輔助治療；添加到嬰幼兒奶粉使之更接近母乳成分[2]；用于化妝品等。國內(nèi)對神經(jīng)酸的研究，主要集中在富含神經(jīng)酸的植物的種植、分離純化等[3]，用于食品行業(yè)則主要集中在兩個新食品原料(順-15-二十四碳烯酸、元寶楓籽油)，而相關的毒理試驗研究較少，僅傅穎[4]等通過試驗證實神經(jīng)酸的大、小鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死量LD50>10g/kg。為了保證神經(jīng)酸的食用安全性，故對神經(jīng)酸(順-15-二十四碳烯酸)的急性毒性、遺傳毒性進行了試驗研究。相關試驗參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[5]。

1.材料與方法

1.1 樣品 神經(jīng)酸(順-15-二十四碳烯酸)，由云南某科技開發(fā)有限公司提供，純度≥85%。樣品為白色片狀粉末。人體每日推薦用量為300mg/60(kg·bw)[5mg/(kg·bw)]。

1.2 試驗動物 選用山東大學實驗動物中心提供的健康SPF級昆明種小鼠。實驗環(huán)境溫度22℃±2℃，相對濕度50%±10%。

1.3 小鼠急性毒性試驗 采用霍恩氏法試驗。小鼠體重 18～22g，隨機分為2.15g/(kg·bw)、4.64g/(kg·bw)、10.00g/(kg·bw)、21.5g/(kg·bw)四個劑量組，每組8只，雌雄各半。分別稱取2.15g、4.64g、10.0g、21.5g送檢樣品置于43℃±2℃水浴中將樣品融化，然后用玉米油分別稀釋并定容至40ml。小鼠空腹16小時后，每間隔4小時以0.20ml/10(g·bw)容量灌胃2次，連續(xù)14天觀察試驗動物有無中毒表現(xiàn)、有無死亡情況。

1.4 神經(jīng)酸的遺傳毒性試驗

1.4.1 Ames試驗:采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型四株試驗菌(TA97、TA98、TA100、TA102)進行試驗。采用大鼠肝勻漿[多氯聯(lián)苯(PCB)誘導]作為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗設5個劑量，每個劑量做3個平行皿。稱取神經(jīng)酸樣品1.25g，用DMSO溶解并定容后滅菌，4℃存放備用。使用前將上述溶液用DMSO稀釋成五組[50000μg/ml(原液)、10000μg/ml、2000μg/ml、400μg/ml、80μg/ml]。在頂層瓊脂中加入0.1ml試驗菌液、0.1ml受試樣品溶液(溶劑對照組加入0.1mlDMSO)和(需要代謝活化時)0.5mlS-9混合液。試驗設自發(fā)回變、溶劑對照和6組陽性對照。在37℃條件下培養(yǎng)48小時，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗重復2次。

1.4.2 小鼠骨髓細胞微核試驗:體重(25～30)g的小鼠60只，隨機分為6組(雌、雄各半)。受試物劑量分別為2.50g/(kg·bw)、5.00g/(kg·bw)、10.00g/(kg·bw)。分別稱取受試物2.50g、5.00g、10.00g置于(43±2)℃水浴中將樣品融化，然后用玉米油稀釋并定容。試驗設陽性對照組[40mg/(kg·bw)劑量的環(huán)磷酰胺]、溶劑對照組(玉米油)、陰性對照組(蒸餾水)，間隔24小時，灌胃2次[灌胃量為0.2ml/10(g·bw)]，末次給受試物后6小時，處死小鼠，取胸骨骨髓涂片，計數(shù)骨髓噬多染紅細胞(PCE)和正染紅細胞(NCE)，計算PCE/NCE比值，并進行統(tǒng)計學處理。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗:體重30g～35g的性成熟雄性小鼠30只，隨機分為6組，每組5只，受試物劑量為2.50g/(kg·bw)、5.00g/(kg·bw)、10.00g/(kg·bw)。分別稱取受試物2.50g、5.00g、10.00g置于43℃±2℃水浴中將樣品融化，然后用玉米油稀釋并定容至20ml，灌胃量為0.20ml/10(g·bw)。試驗設陽性對照組[40mg/(kg·bw)劑量的環(huán)磷酰胺]、溶劑對照組(玉米油)、陰性對照組(蒸餾水)，連續(xù)5天灌胃，末次灌胃30天后處死雄性小鼠，取附睪制片，計數(shù)，計算精子畸形率(以百分率計)，并進行統(tǒng)計學處理。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)分別進行χ2檢驗、One-way ANOVA分析、Fisher精確概率法及Dunnett檢驗，檢驗水準α=0.05。

2.結果與分析

2.1 小鼠急性毒性試驗 由表1可知，將受試樣品分別以2.15g/(kg·bw)、4.64g/(kg·bw)、10.00g/(kg·bw)、21.5g/(kg·bw)的劑量給小鼠灌胃后，連續(xù)14天觀察期內(nèi)，各劑量組雄、雌小鼠均未見死亡和明顯的中毒癥狀。將受試動物處死后解剖，主要器官(肝、脾、腎、心、肺、胃、腸等)未見明顯異常改變。受試物對雌雄大、小鼠急性經(jīng)口LD50均大于21.5g/(kg·bw)，屬無毒級。

表1 神經(jīng)酸對小鼠的急性毒性試驗結果

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗：由表2、表3可知，受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也無量-效關系。在加與不加S-9時，對四株試驗菌株(TA97、TA98、TA100、TA102)均未呈現(xiàn)出遺傳毒性。

表2 神經(jīng)酸Ames試驗結果(No.1)

表3 神經(jīng)酸Ames試驗結果(No.2)

2.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗:由表4可知，與陰性對照組相比，雄、雌小鼠各劑量組的微核細胞率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；環(huán)磷酰胺組(CP)的微核細胞率有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。受試樣品神經(jīng)酸對小鼠骨髓細胞微核率無影響，且試驗各組均未出現(xiàn)明顯的細胞毒性。

表4 神經(jīng)酸對小鼠骨髓微核率的影響

注：*代表顯著水平(P<0.01)。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗:由表5可知，受試樣品各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺組(CP)與陰性對照組比較有顯著差異(P<0.01)，說明神經(jīng)酸對小鼠精子畸形率無影響。

表5 神經(jīng)酸對小鼠精子畸形率的影響

注：*代表顯著水平(P<0.01)。

3.結論

本次研究在第一階段急性毒性試驗中，大、小鼠的LD50>21.5g/(kg·bw)，屬無毒級。第二階段通過三項遺傳試驗(Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、 小鼠精子畸形試驗)對受試樣品的遺傳毒性進行了探討，結果表明三項遺傳試驗均為陰性。綜合以上毒性和致突變檢測結果可以認為，在本實驗條件下神經(jīng)酸原料屬無毒級，且無致突變性，符合食用安全要求。

目前，國內(nèi)對神經(jīng)酸的研究主要集中在兩個新食品原料(順-15-二十四碳烯酸、元寶楓籽油)的基礎研究(包括富含神經(jīng)酸的植物[3，6，7]、提取工藝[8]、合成工藝[9]等)，國外研究集中在分離提取、功效性[10，11]和應用[12，13](嬰幼兒配方乳粉、相關疾病的治療藥物等)。純度≥85%的“神經(jīng)酸”原料的安全性相關研究還較少，故而本研究對神經(jīng)酸的毒性進行了研究，對90天喂養(yǎng)試驗、致畸試驗也進行了研究(本文受篇幅限制，試驗內(nèi)容不在此體現(xiàn))，結論表明，神經(jīng)酸符合食用安全要求。希望在此基礎上，能加快相關產(chǎn)品商業(yè)化的步伐，讓其產(chǎn)生更加廣泛的社會效益。