龍春頻 歐陽堅

【摘 要】 目的：分析紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達。方法：選取我科學(xué)院肝癌細胞，即HepG2，對肝癌細胞進行培養(yǎng)以及藥物處理，然后采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測對凋亡細胞進行檢測，最終測定miR-224的表達。結(jié)果：通過檢測，發(fā)現(xiàn)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導(dǎo)細胞凋亡，與空白對照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導(dǎo)細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現(xiàn)更高;在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯升高，但是當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯下降。而當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數(shù)均明顯升高。結(jié)論：紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡時，miR-224表達上調(diào)，上調(diào)的miR-224可作用于其靶基因，進而對肝癌細胞的凋亡途徑造成影響。

【關(guān)鍵詞】 紫杉醇;誘導(dǎo);肝癌HepG2;細胞凋亡;miR-224;表達

【中圖分類號】R285. 5

【文獻標(biāo)志碼】B

【文章編號】1005-0019（2020）02-239-01

肝癌在臨床上比較常見，尤其是原發(fā)性肝癌，有數(shù)據(jù)顯示，我國原發(fā)性肝癌的發(fā)病率占全球發(fā)病率的55%左右，而死亡率占全球死亡率的45%[1]。紫杉醇是臨床上應(yīng)用比較廣泛的一種高效廣譜癌癥化療藥物，其能夠作用于微管蛋白β亞基N端第31位氨基酸， 在促進微管聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的同時，還阻止了其向亞單位的解聚，進而對微管聚合以及解聚的動態(tài)平衡造成了極大的影響，進而引發(fā)了癌癥細胞的凋亡或者死亡，另外，其還能夠?qū)毎こ⒔Y(jié)構(gòu)進行改變，最后發(fā)揮出其抗腫瘤的作用。微小RNA則能夠?qū)捂溞》肿覴NA進行調(diào)控。本次研究就對紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達進行了詳細的分析。具體如下：

1 資料與方法

1.1 對肝癌細胞的培養(yǎng)和藥物處理

選取我科學(xué)院肝癌細胞，即HepG2，取含有10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基對肝癌細胞進行接種，再將其放置在濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)箱的溫度調(diào)整為37℃，培養(yǎng)24h后，再將培養(yǎng)基換成濃度為2、1、1.5mg/L的紫杉醇，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。

1.2 凋亡細胞的檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測法對凋亡細胞進行檢測，取Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。先取不含EDTA的胰蛋白酶對肝癌細胞進行消化，將血液離心儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為2000r/min，離心5min后，對鐵壁細胞1～5×105進行收集，然后用PBS對細胞進行洗滌，洗滌2次后在其中加入500μL的Binding buffer，再在其中依次加入5μL的Annexin V-FITC、5μL的Propidium Iodide后混勻，放在避光的環(huán)境下讓其反應(yīng)5～15min。再用流式細胞儀進行檢測，將細胞儀的激發(fā)波長、發(fā)射波長分別調(diào)整為488nm和530nm，通過FITC通道對Annexin V-FITC綠色熒光進行檢測，通過PI通道對PI紅色熒光進行檢測。

1.3 miR-224表達的測定

定量PCR引物的設(shè)計與合成均通過Primer BLAST進行，對肝癌細胞中總RNA進行提取時，嚴格按照試劑盒中的說明書進行操作。采用TRIpure Reagent總RNA對RNA進行抽取和分離，將提取到的RNA用濃度為1.2%的瓊脂糖進行電泳，并用K5500超微量分光光度儀對其濃度和純度進行測定。將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后實時定量PCR擴增和檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察肝癌HepG2細胞凋亡情況以及細胞中miR-224的表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，分別用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差和%表示計量資料和計數(shù)資料，用t和χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05表示差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細胞凋亡檢測結(jié)果

通過檢測，發(fā)現(xiàn)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導(dǎo)細胞凋亡，與空白對照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導(dǎo)細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現(xiàn)更高。詳見表1：

2.2 miR-224的表達

在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯升高，但是當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯下降。而當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數(shù)均明顯升高。

3 討論

有研究人員經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs基因與肝癌的發(fā)生、治療以及患

作者簡介 ：龍春頻 ，男 ，漢族， 1970年 12月生， 江西萍鄉(xiāng)， 本科學(xué)歷 ， 高級講師，主要從事中藥與腫瘤的研究。

通訊作者： 歐陽堅，萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院腫瘤研究實驗室，郵箱： jouyang168@163.com。

者預(yù)后評估等密切相關(guān)。其經(jīng)常會出現(xiàn)在一些與腫瘤相關(guān)的易變基因環(huán)境中，但是又有一大部分存在于與癌癥相關(guān)基因區(qū)域，或者一些比較脆弱性的位點上。如果某類miRNA的靶基因是抑制癌癥的基因，當(dāng)此類miRNA出現(xiàn)明顯的增加，靶基因表達減少時，就提示有可能出現(xiàn)了腫瘤。但是如果靶基因是致癌基因，當(dāng)相應(yīng)的miRNA表達減少，或者作用于靶點的突變導(dǎo)致癌基因表達異常增高時，則極有可能會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，此時，除了抑制癌癥的基因外，另外一部分則被認定為是致癌基因。有研究人員經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，miR-224是肝癌癌變相關(guān)的miRNA，這也進一步提示miRNA在體外和體內(nèi)肝細胞中的表達是一致的，尤其可能在維持肝癌細胞惡性表型的過程中起著極其關(guān)鍵的作用[2]。

有研究人員認為，miR-224對細胞增殖的作用，遷移、侵襲以及肝癌細胞抗凋亡等均與靶基因密切相關(guān)，因此，可發(fā)現(xiàn)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中都涉及到了該DNA[2]。也有文獻報道顯示，在被檢肝癌組織中，均發(fā)現(xiàn)了肝癌組織中的miR-224其定量檢測結(jié)果顯示，該miRNA的表達也出現(xiàn)了明顯的增加。因此，也可認為肝癌組織中存在著明顯的miRNA表達水平的變化，而此種定時熒光定量RT-PCR法也為早期、準(zhǔn)確的檢測肝組織是否發(fā)生了癌變提供了新的思路[3]。

本次研究結(jié)果顯示，當(dāng)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導(dǎo)細胞凋亡，48h更劇烈誘導(dǎo)細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現(xiàn)更高。而在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯下降，而當(dāng)紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數(shù)明顯升高。但是當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數(shù)均明顯升高。這可能是因為剛開始使用低濃度的紫杉醇，會有一個適應(yīng)期，細胞凋亡下過并不明顯，但是將紫杉醇濃度增高時，HepG2miR-224的表達會升高，進而引發(fā)了細胞凋亡[4]。

綜上所述，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡時，miR-224表達上調(diào)，上調(diào)的miR-224可作用于其靶基因，進而對肝癌細胞的凋亡途徑造成影響。

參考文獻

[1] 薛婭，耿文峰，伍春蓮.紫杉醇與白藜蘆醇單體及聯(lián)合用藥誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細胞凋亡的比較研究[J].西華師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，37（04）：385-389+395.

[2] 單長民，孫業(yè)盈，李娟，等.紫杉醇誘導(dǎo)HepG2肝癌細胞凋亡中miR-224沉默凋亡抑制因子5基因的作用[J].解剖學(xué)報，2015，46（04）：521-527.

[3] 單長民，王東，李娟，等.初探紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達[J].藥物生物技術(shù)，2014，21（06）：494-497.

[4] 單長民，李京敏，李娟，等.試驗用和臨床用紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（06）：1711-1713+1738.