王瑤， 武曼麗， 鄭鋒玲， 劉珊， 駱歡歡

（1.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州 501405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學期刊中心，廣東廣州 510006）

濕熱證候在中醫(yī)臨床上較常見，且涉及的疾病譜也較廣泛，如感染性疾病、慢性代謝性疾病以及各系統(tǒng)疾病中均可出現(xiàn)濕熱證的病理改變。臨床研究表明，濕熱證常包括多個子證型，主要有脾胃濕熱、脾虛濕熱、下焦?jié)駸?、肝膽濕熱等；相關疾病分屬多個系統(tǒng)，以消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病最為多見[1]。濕熱證的臨床表現(xiàn)以身熱不揚、胸脘痞悶、身重體倦、大便黏滯不爽、舌紅苔黃膩、脈象滑數(shù)為主癥，以病情纏綿難愈為顯著臨床特征。中醫(yī)病機學理論認為，濕熱致病不離“濕熱膠著”和“內(nèi)外相引”。濕熱膠著，濕與熱易于合而為患，濕蘊熱內(nèi)，熱處濕中，濕熱相合，如油入面，膠結難分，難于速去，致使病情復雜、病程遷延。嗜食肥甘厚味、飲酒無度等可致濕熱內(nèi)生，若外界環(huán)境濕熱氤氳，同氣感召，則內(nèi)外濕熱相加為害致使病情反復發(fā)作，纏綿難愈。中醫(yī)臨床對濕熱證的治療頗感棘手，也嚴重影響了中醫(yī)對疾病的整體治療效果。

證候機理的研究是臨床療效提高的前提。深入闡釋濕熱證的證候本質(zhì)，對于濕熱致病條件下，如何做到既病防變，精準治療，突破治療瓶頸，進而提高病證整體療效具有重要的意義。近年來隨著對中醫(yī)濕熱證候研究的增多，中醫(yī)濕熱證動物模型構建方法也在不斷創(chuàng)新，研究結果部分反映了濕熱證候的特征及本質(zhì)，然而其模型構建因素、成模標準、實際運用等均不能真正滿足基礎研究及臨床中醫(yī)現(xiàn)代化研究的需要。以下對近年來中醫(yī)濕熱證候的研究進展進行述評。

1 基于中醫(yī)病機學說構建濕熱證動物模型概況

1.1 溫病濕熱證動物模型清代醫(yī)家柯韻伯所述“實則陽明，虛則太陰”，言簡意賅地指出了外感溫病濕熱證的病機發(fā)展特點?；诖?，有學者根據(jù)傳統(tǒng)溫病分類方法分別制備溫病濕熱證濕重于熱、熱重于濕的模型，將“中氣實”“中氣虛”與“內(nèi)濕”“外濕”相互結合。

熱重于濕模型的建立通常采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境，通過高脂高糖飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境，采用灌胃附子干姜煎劑或大黃附子湯煎劑、灌胃鼠傷寒沙門氏菌或大腸桿菌以造成脾虛等綜合方式。結果顯示此種熱重于濕大鼠模型，其胃動素（MTL）和胃泌素（GAS）均較正常組降低，大鼠呈現(xiàn)體溫升高，飲水量、飲食量、小便量減少，大便黏滯，喜打斗、毛色暗黃無光澤等現(xiàn)象；血清蛋白質(zhì)組學差異表達研究顯示，熱重于濕大鼠血清中可見12 個具有差異性表達的蛋白質(zhì)斑點[2-3]。

濕重于熱模型采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境、高脂高糖飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境、灌胃大黃煎劑或小承氣湯、灌胃鼠傷寒沙門氏菌或不使用生物學因素等綜合因素建立。結果顯示此種濕重于熱組小鼠血清D-木糖、血清淀粉酶低于正常對照組，大鼠大便稀薄程度和小便量增多程度顯著高于熱重于濕組和正常對照組，濕重于熱組舌組織固有層炎癥、充血及水腫較濕熱并重組更顯著[4-5]。

濕熱并重模型采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境、高脂高糖或高蛋白飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境、灌胃白酒模擬生活因素、灌胃鼠傷寒沙門氏菌或不使用生物學因素等綜合因素建立。結果顯示此種濕熱并重大鼠的MTL 水平明顯高于熱重于濕組，GAS 稍微高于熱重于濕組，小鼠存在腸道菌群結構失調(diào)，表現(xiàn)為大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬等條件致病菌過度增長[3，6]。

1.2 臟腑病機濕熱證動物模型薛生白《濕熱病篇》謂：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱。”脾胃為后天之本、氣血生化之源，脾喜燥而惡濕，同氣感召，故濕熱常易傷脾。有學者根據(jù)脾胃濕熱證的病機以及臨床表現(xiàn)，研究內(nèi)外因結合造模法，即濕熱環(huán)境加高脂高糖飲食加白酒或飲食失節(jié)的綜合造模方法，結果顯示此種脾胃濕熱模型大鼠飲食減少、精神萎靡、毛發(fā)疏松粗糙，大便時干時溏，血清GAS 水平升高，腸組織中MTL 水平也升高，胃竇處有明顯的潰瘍和糜爛[7-8]。韋嵩等[9]采用人工氣候箱、高脂高糖飲食、水楊酸鈉灌胃等方法構建慢性胃炎脾胃濕熱證模型，結果顯示模型組大鼠飲食量、飲水量明顯較正常組降低，體質(zhì)量下降，水通道蛋白3（AQP3）、水通道蛋白4（AQP4）基因表達水平高于脾虛組。

中醫(yī)認為，大腸為“傳道之官，變化出焉”。大腸濕熱證臨證常見“腹痛下痢，里急后重”。有學者采用高糖高脂飼料、人工氣候艙結合產(chǎn)毒性大腸桿菌灌胃造模，發(fā)現(xiàn)按此種方法建立的大腸濕熱模型大鼠可出現(xiàn)肛溫上升、肛門紅腫出血、食欲不振等癥狀，幾乎全部模型大鼠的腸管黏膜出現(xiàn)彌漫性充血、水腫，大量黏液和纖維蛋白滲出，病變主要見于十二指腸、空腸回腸、乙狀結腸、直腸；電鏡下可見腸組織細胞間隙擴大，細胞器腫脹，微絨毛稀疏變短[10-11]。也有學者采用以喂食肥甘及辛辣飼料、人工氣候箱為基礎，先后灌胃克林霉素磷酸酯及大腸桿菌的方法建立抗生素相關性大腸濕熱證大鼠模型，結果顯示模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、喜扎堆、攝食減少、被毛稀疏無光澤、大便黏膩、排便次數(shù)增加等表現(xiàn)[12]。除出現(xiàn)以上外觀表現(xiàn)外，模型大鼠還出現(xiàn)血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸含量升高，結腸組織過氧化物酶（MPO）含量升高，腸黏膜分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量降低，腸內(nèi)容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，而腸球菌、大腸桿菌顯著增加等表現(xiàn)[12]。

有學者先用異硫氫酸苯酯灌胃誘導大鼠肝損傷，之后以人工氣候艙、高脂高糖飲食構建肝膽濕熱證膽汁淤積模型大鼠，結果顯示黃疸濕熱組模型大鼠體質(zhì)量下降明顯，肛溫升高顯著，血清膽紅素、膽汁酸水平升高顯著，并可見肝小葉欠完整，肝臟細胞腫脹變性，可見點狀壞死等肝內(nèi)膽汁淤積的病理特點[13-15]。也有學者[16]采用辛辣、油膩飼料喂養(yǎng)家兔構建膽囊炎濕熱蘊結動物模型，結果發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)膽固醇結晶、膽囊黏膜粗糙等現(xiàn)象；光鏡下可見黏膜的膜上皮萎縮、肌層增厚，并出現(xiàn)炎性細胞及滲出物。

2 濕熱證候動物模型構建現(xiàn)狀分析

2.1 構建機理1988 年，郭金龍等[17]率先提出基于中醫(yī)學“外濕引動內(nèi)濕”理論制備濕熱動物模型，通過人工氣候艙模擬長夏濕熱環(huán)境造成外濕，飼喂大鼠“豬脂加蜂蜜”損傷脾氣，使脾胃運化失常造成內(nèi)濕；二者相互結合，制備濕熱證候模型。1990年，王新華[18]在之前濕熱證模型基礎上聯(lián)合大腸桿菌內(nèi)毒素的生物學因素建立濕熱證模型，其后吳仕九等[19]以濕熱證的發(fā)病機理、臨床表現(xiàn)以及西醫(yī)傳染病學為基礎，研究了6種不同的造模方法，最后認為以飲食因素、氣候環(huán)境因素、鼠傷寒沙門氏菌感染的綜合因素造模方法比較理想。

濕熱一證的致病機理始終不離飲食、環(huán)境、生物因素、疾病等，故其證候模型的構建始終重視以上相關因素[20]。飲食因素的構建常采用高脂、高糖飲食如“豬脂加蜂蜜”措施，或高蛋白飲食，此類方法均符合中醫(yī)學理論，且能有效造成一定程度的代謝功能紊亂[17]。部分學者在造模中采取飲食失節(jié)的措施模擬脾胃損傷使脾失運化，也符合“太陰內(nèi)傷”濕重于熱的中醫(yī)病機機理的。然而，大鼠、小鼠、兔等有著不同于靈長類的飲食結構需求，且該“脾失運化”未能有效通過客觀指標證實。

對氣候環(huán)境因素的構建方法，各位學者相對較為統(tǒng)一，多采用人工氣候艙構建高溫高濕環(huán)境，但溫度、濕度沒有統(tǒng)一的標準。值得一提的是，人工氣候艙作為濕熱證構建的重要工具，其性能穩(wěn)定性堪憂，亟待環(huán)境溫度濕度變動小、顯示清晰、有一定通風功能的改良人工氣候艙面世。

生物因素與疾病造模方法，其立意源于溫病濕熱證理論或疾病濕熱證理論，從而形成了疾病證候模型，然而如何評價疾病對證候的影響，是值得研究探索的關鍵問題。另外，以多因素復合方式構建的濕熱證候模型，因涉及施加因素太多，造成后期成模標準與因素分析的復雜化、不確定性。

2.2 模型動物本研究以“濕熱，小鼠，模型”為關鍵詞在中國知網(wǎng)上搜索，顯示結果為91 條，在萬方學位論文數(shù)據(jù)庫上顯示結果為25 條；以“濕熱，大鼠，模型”為關鍵詞在中國知網(wǎng)上搜索，顯示結果為191條，在萬方學位論文數(shù)據(jù)庫上顯示結果為147條；以“濕熱，兔”為關鍵詞搜索僅僅找到數(shù)篇相關文獻?？梢娔壳皾駸嶙C模型的造模動物多以大鼠、小鼠為主。

中醫(yī)辨證診斷信息主要基于望、聞、問、切四診。隨著近年來中醫(yī)現(xiàn)代化的進程，中醫(yī)辨證診斷亦亟待客觀化指標的補充與豐富，而證候動物模型的發(fā)展遲緩大大限制了中醫(yī)證候客觀化研究。其中的制約因素之一即是大鼠、小鼠、兔等證候模型的構建程度的不確定性，主要表現(xiàn)為上述動物模型癥狀、體征、舌象、脈象的不確定性，使證候模型時常呈現(xiàn)說服力不足的局面。

2.3 成模標準望、聞、問、切四診是中醫(yī)辨證的主要信息采集方法，因此雖然造模方法多種多樣，但成模標準總離不開臨床表現(xiàn)。濕熱證候模型多以觀察動物的體質(zhì)量、背毛、活動、飲食及飲水量、糞便等為主，而僅以此來判斷造模成功與否是缺乏嚴謹性的；且以上變量指征的可控性和可重復性較差，也未能反映中醫(yī)診斷學中舌診、脈診的內(nèi)容。如在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠自身體溫變動極大，不宜用于模擬溫病濕熱證的體溫改變。

隨著中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展，濕熱證候的生物學基礎也得到了廣泛而深入的研究，免疫炎癥、氧化應激、脂質(zhì)代謝、水通道蛋白等相關通路與濕熱證候模型均呈現(xiàn)顯著關聯(lián)，部分指標甚至具有相對特異性，如脂多糖（LPS）、Toll 樣受體4（TLR4）、核因子κBp65（NF-κBp65）、水通道蛋白3（AQP3）等[21-24]。近年來，宏基因組學、基因組學、代謝組學、蛋白組學等技術快速發(fā)展，通過測序后發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證候的特異性生物標志物的研究也受到了廣泛關注，濕熱證候模型成模標準的研究也出現(xiàn)了新的方向。有學者對濕熱證候模型小鼠的組學進行研究，結果顯示模型小鼠腸道菌群、血清蛋白質(zhì)組學出現(xiàn)了一些規(guī)律性的改變[25-26]。

3 濕熱證候模型構建方法的改良思路

3.1 構建機理的改良在既往眾多研究者對濕熱證候模型的探索、歸納、總結的基礎上，有研究者嘗試以高糖飲食、高脂飲食、高蛋白飲食，及濕熱環(huán)境等因素分別造模，結果發(fā)現(xiàn)單純的濕熱環(huán)境、單純的高脂飲食均能使小鼠呈現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢、背毛潮濕、陰囊下墜、大便黏滯等表現(xiàn)，并同時存在LPS、TLR4、AQP3 及舌、結腸HE 染色病理、腸道菌群的改變[25-26]，可部分解決復合因素造?？芍貜托圆?、不確定性大的弊端。

3.2 模型動物的選擇為盡量模擬展示濕熱證候模型的四診資料如舌象、脈象等，可選擇一些比較接近人類的生理特性的動物，非人靈長類動物是目前較為合適的選擇。非人靈長類與人類基因組序列具有高度的同源性，在生理結構、代謝周期、行為方式等方面與人類有高度相似性。如獼猴也有ABO 血型，雌性獼猴性周期為21 ～28 d，月經(jīng)周期2 ～3 d，這些都與人類高度相似。作為世界范圍內(nèi)分布最廣的非人靈長類，獼猴屬（Macaca）物種是科學研究的重要模型動物，特別是在生物醫(yī)學模型的研究中發(fā)揮了重要作用[27-28]。目前獼猴在生物醫(yī)學中的應用主要用于傳染病研究、疫苗實驗、藥理毒理學研究、器官移植研究等方面，獼猴的生理與病理特性與人類高度相關。故認為可采用獼猴作為濕熱證候模型動物，并進行中藥干預。目前廣東、云南、海南、廣西等地均有成熟獼猴實驗基地，利用這些地區(qū)的天然濕熱氣候構建濕熱證候模型是可行的。

除此之外，近年來腸道微生態(tài)、基因測序等在濕熱證候研究中受到了極大的重視，無菌動物、基因敲除動物也是探索濕熱證候病證結合的理想模型動物。

3.3 成模標準的確立目前評價濕熱證候模型缺乏統(tǒng)一的成模標準，這不僅僅阻礙了濕熱證候模型的發(fā)展，也為后續(xù)濕熱證候相關疾病的研究及藥物研發(fā)增加了阻力，是濕熱證候研究亟待解決的核心技術問題?！罢w觀念”和“辨證論治”為中醫(yī)學的兩大基本特點，濕熱證候及其他中醫(yī)證候模型的研究均不能將此二者忽視。成模標準應兼具針對性及客觀性，需要形成一套既符合中醫(yī)學辨證理論，又可以穩(wěn)定地在動物模型上體現(xiàn)的指標體系，故若能涵蓋表觀學、舌象圖片分析、舌組織HE染色病理、血液指標檢測、蛋白組學等的指標體系可能更有優(yōu)勢。濕熱證候由多因素致病，濕熱證候模型成模標準應有多個指標，這些指標間是相互關聯(lián)的，若只是用其中一個指標來評價模型成功與否，與中醫(yī)學“整體觀念”顯然是相悖的。各指標之間應有一個主次的權重關系，以此判斷造模成功與否。

中醫(yī)證候研究應始終基于臨床。深化濕熱證候生物學基礎研究亦需基于臨床實際，細化成模標準，并參照濕熱證候理論進行反向驗證，不斷改進。中醫(yī)證候模型的發(fā)展是中醫(yī)藥現(xiàn)代化一個至關重要的環(huán)節(jié)，如何制作能更有效模擬的科學的中醫(yī)證候模型將是今后證候模型研究的方向。