李林， 孫曉靜， 孫治中， 陳曦霞， 張玲， 曾笑晴， 湯水福， 程德金

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科，廣東廣州 510400；3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006）

流行病學顯示，慢性腎臟病的發(fā)病率約為10.8%[1]。慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是在各種慢性腎臟病基礎上緩慢出現(xiàn)腎功能進行性減退直至衰竭的一種臨床綜合征，屬于中醫(yī)學“溺毒”“癃閉”“關格”“腎勞”“虛勞”等病證的范疇。目前，西醫(yī)治療慢性腎衰竭主要以治療原發(fā)病及并發(fā)癥為主，對于進行至終末期腎病的患者，一般采用腎臟替代療法。中醫(yī)藥在治療慢性腎衰竭方面有明顯的優(yōu)勢，中藥大黃在治療慢性腎衰竭方面尤為突出[2-3]。然而，目前對于單味中藥大黃治療慢性腎衰竭的具體機制尚不明確，因此，本研究運用網絡藥理學從分子水平預測大黃治療慢性腎衰竭的作用機制，以期為下一步深入研究提供參考和指導，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分的獲取以“大黃”為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點擊其成分的詳細信息，保存活性成分的2D結構。

1.2 預測大黃相關靶點從Pubchem 數(shù)據(jù)庫中檢索篩選出大黃的活性成分，找出它們對應的smile號，保存為SDF文件，上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），基于反向分子對接原理，依據(jù)各成分的2D/3D結構進行靶點預測，得到大黃的預測靶點。

1.3 慢性腎衰竭相關靶點的獲取及與大黃預測靶點的映射以“chronic renal failure”為檢索詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取慢性腎衰竭相關靶點。將大黃的預測靶點與慢性腎衰竭相關靶點進行映射，得到大黃治療慢性腎衰竭的預測靶點。

1. 4 蛋白與蛋白相互作用（PPI）網絡的構建通過String 數(shù)據(jù)庫設定物種為“Homo snpiens”獲取全部蛋白—蛋白相關作用關系，導入Cytoscape 3.6.0 軟件，生成背景網絡。在背景數(shù)據(jù)庫選中上述映射得到的大黃作用于慢性腎衰竭的靶點，并找到與其直接相連的節(jié)點，作為大黃治療慢性腎衰竭的PPI網絡。

1. 5 Hub 網絡的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中的NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network 進行網絡分析獲取相關拓撲參數(shù)，選取節(jié)點連接度（degree）的二倍中位數(shù)、節(jié)點介度（betweenness）和節(jié)點緊密度（closeness）的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，提取出Hub網絡。

1.6 基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應用Cytoscape 3.6.0 軟件中ClueGO 插件， 選擇生物進程（Biological Process），對Hub網絡中的靶標進行GO富集分析。通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網站對上述分析結果進行KEGG通路分析并進行篩選，得到顯著富集（P ＜0.01）的通路，并按照gene數(shù)從大到小排序。結合文獻檢索，篩選出治療慢性腎衰竭的可能通路，找到其通路上的相關靶標，結合大黃的活性成分，構建出“大黃活性成分—慢性腎衰竭靶標—KEGG通路”的網絡圖。選取gene 數(shù)排名前20 的通路，使用OmicShare 網站（http：//www.omicshare.com/tools/）繪 制 通 路 氣 泡圖。

2 結果

2.1 大黃活性成分本研究將OB ≥30%、DL ≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物16種，化合物名稱、相關參數(shù)及化學結構式見表1。

2.2 大黃預測靶點以及活性成分—慢性腎衰竭靶點網絡構建從SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中篩選出16 種活性化合物對應的240 個靶點，再依據(jù)成分的2D/3D結構進行靶點預測，篩選出122個靶點作為大黃的預測靶點。將所得的大黃預測靶點與GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取的6 329 個慢性腎衰竭相關靶點相映射，最后篩選出大黃可能與慢性腎衰竭相關的靶點93 個。在Cytoscape 3.6.0 軟件中導入大黃的活性成分與慢性腎衰竭相關的靶點，構建大黃活性成分—慢性腎衰竭靶點網絡圖，如圖1所示。

表1 大黃活性成分Table 1 The data of the active components of Radix Et Rhizoma Rhei

2.3 PPI 網絡的構建將93 個大黃可能與慢性腎衰竭相關的靶點導入String數(shù)據(jù)庫蛋白—蛋白相關作用關系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成大黃治療慢性腎衰竭的PPI 網絡。見圖2。圖中節(jié)點大小是按degree值的大小形成，degree值越大，節(jié)點越大。

圖1 大黃活性成分—慢性腎衰竭靶點網絡圖Figure 1 Radix Et Rhizoma Rhei active components-CRF targets network

圖2 大黃治療慢性腎衰竭的PPI網絡Figure 2 PPI network of Radix Et Rhizoma Rhei treatment for CRF

2.4 Hub網絡的提取及Hub中的靶標選取degree的二倍中位數(shù)、betweenness 和closeness 的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標，即大黃治療慢性腎衰竭的關鍵靶點，提取出Hub 網絡。見圖3。圖3 中黃色示大黃和慢性腎衰竭相關的靶點，紅色示大黃和慢性腎衰竭相關的靶點在人類基因庫中直接相關的靶點。關鍵靶點共30 個，按照degree 值從大到小排序分別為：SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、 MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、 EGFR、PRKCA、SMAD3、STAT1、PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

2.5 GO富集分析應用Cytoscape 3.6.0中ClueGO插件，進行GO 富集中的BP 分析，得到11 個功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。

2. 6 KEGG 通路分析通過KEGG 通路分析得到122條通路，結合文獻檢索，篩選出治療慢性腎衰竭的可能通路為20 條，繪制通路氣泡圖。見圖6。分別為磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）—蘇氨酸激酶（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Ras信號通路、Foxo信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、胰島素信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、Toll 樣受體信號通路、Janus 激酶（JAK）—信號轉導子和轉錄激活子（STAT）信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路、Wnt 信號路、Hippo 信號通路、P53 信號通路、轉化生長因子β（TGF-β）信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、Notch 信號通路、醛固酮調節(jié)鈉重吸收通路。

3 討論

慢性腎衰竭的共同病理表現(xiàn)為腎臟纖維化，腎臟纖維化的持續(xù)發(fā)展最終將導致腎衰竭，因此，有效緩解腎纖維化就能有效延緩慢性腎衰竭的進展。

圖3 Hub網絡Figure 3 Hub network

圖4 GO富集分析功能組別圖Figure 4 Functional group diagram of GO enrichment analysis

圖5 GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart of functional group proportion by GO enrichment analysis

3.1 靶點預測預測結果表明，大黃治療慢性腎衰竭的關鍵靶點有30個，按degree值（從大到小排序）具體為SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、 GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、EGFR、 PRKCA、 SMAD3、 STAT1、 PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

其中包括促進腎纖維化和抑制腎纖維化的靶點，如SRC 為促進腎纖維化靶點。SRC 屬于非受體細胞內酪氨酸蛋白激酶家族，在細胞中廣泛存在，當其在Tyr416 位點磷酸化而活化后可以進一步激活TGF-β1、STAT3、EGFR 促纖維化的信號通路，在腎間質纖維化發(fā)生及加重過程中有重要意義。研究表明，通過PP1抑制SRC活化后可通過抑制內吞而使MMP-2活性提高，而MMP-2活性提高后可促進細胞外基質的降解，有助于腎間質纖維化的逆轉。因此，本研究進一步支持SRC 作為腎間質纖維化治療潛在靶點的可能性[4]。

圖6 大黃治療慢性腎衰竭前20條富集通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram of the top 20 of pathway enrichment

而大部分靶點通路可以延緩腎纖維化，改善腎功能。如STAT3、STAT1 可通過調控JAK1、JAK2、STAT3的基因達到改善腎功能目的[5]。

3.2 大黃治療慢性腎衰竭的預測通路預測通路共20 個，分別為PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Ras信號通路、Foxo信號通路、TNF信號通路、胰島素信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、VEGF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、Jak-ATAT 信號通路、cAMP 信號通路、Wnt 信號路、Hippo 信號通路、P53 信號通路、TGF-β 信號通路、AMPK 信號通路、mTOR 信號通路、Notch信號通路、醛固酮調節(jié)鈉重吸收通路。

腎纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展為慢性腎衰竭的共同途徑。目前，關于腎纖維化相關研究的信號通路包括TGF-β1/Smad 通路、血小板衍生生長因子（PDGF）/PDGF 受體（PDGFR）信號通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK相關信號通路等[6]。

既往研究表明，大黃的最主要活性成分為大黃酸、大黃素。通過對梗阻性腎病模型的研究得到證實，大黃酸可以不同程度抑制腎間質纖維化，保護殘余腎功能，延緩腎功能進展，同時，可以下調α-SAM 和TGF-β1 的表達[7]。TGF-β1 是一種重要的細胞因子，它通過控制細胞外基質（ECM）的合成與降解而促使腎臟的纖維化加劇[8]。此外，大黃酸可下調氧化損傷標志物的表達，從而延緩腎臟纖維化[9]。大黃素能降低糖尿病腎病大鼠腎組織中纖連蛋白的表達，阻止p38 MAPK 通路的激活[10]，下調腎臟內TNF-α 與白細胞介素（IL）-6 的表達，抑制腎小球上皮細胞的增生，下調Toll 樣受體4 的表達，緩解腎臟的炎癥狀態(tài)[11]，阻斷NRK-49F細胞激活p38/ERK1/2 信號通路，抑制細胞外基質的形成[12]，從而延緩腎臟纖維化。

綜上所述，大黃對慢性腎衰竭的治療作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，其機制主要與調控腎纖維化相關通路有關，為后續(xù)的深入研究奠定了基礎。