張煜，楊佩芳，陳霞，欒曉瑾，顏一丹，于駿

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

FLCN基因于2002年從Birt-Hogg-Dube綜合征(Birt-Hogg-Dube syndrome，BHD)患者中克隆獲得，其定位于17號染色體短臂(17p11.2)[1]。FLCN結(jié)構(gòu)和功能高度保守，在多種生命過程中都發(fā)揮重要作用[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCN基因在遺傳性腎癌中發(fā)揮抑癌基因作用[3]。但是FLCN基因在子宮頸鱗癌中的致病機(jī)制仍不明確。本研究通過改變?nèi)俗訉m頸鱗癌SiHa細(xì)胞系中FLCN表達(dá)水平，探討FLCN與子宮頸鱗癌的關(guān)系，及其對SiHa細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2017年12月至2018年11月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科診治的27例子宮頸鱗癌患者(子宮頸鱗癌組)和27例因婦科良性腫瘤行全子宮切除術(shù)者(對照組)。其中，子宮頸鱗癌組平均年齡(53.72±9.63)歲，對照組平均年齡(48.48±7.45)歲。所有患者均未接受任何抗癌治療，標(biāo)本均經(jīng)病理證實。排除標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌之外其他病理類型的子宮頸癌，合并內(nèi)外科基礎(chǔ)疾病，伴有其他惡性腫瘤疾病及服用特殊藥物者，排除家族有遺傳性疾病、特別是遺傳性腎癌者。所有患者簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理道德委員會同意。

1.1.2 標(biāo)本處理 對照組和子宮頸鱗癌組宮頸組織標(biāo)本離體后立即用0.9%生理鹽水沖洗去除血漬，剪成1～2 cm3，分成2份，其中1份于-80 ℃保存，用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)；另1份立即行甲醛固定，送至江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，制成蠟塊，經(jīng)4 μm連續(xù)切片后行免疫組化檢測。

1.1.3 主要試劑和儀器 子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞系(美國ATCC細(xì)胞庫)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；qRT-PCR引物序列、兔抗FLCN多克隆抗體(生工生物公司)；胎牛血清、DMEM、DPBS(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；Opti-MEM(美國Gibco公司)；FLCN-eGFP(北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司)；FLCN siRNA(吉瑪基因公司)；磷酸化組蛋白H3(PH3)一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；cy3標(biāo)記抗兔IgG(H+L)熒光二抗(美國Jackson公司)；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒及TUNEL凋亡細(xì)胞檢測試劑盒(諾唯贊公司)。

實時PCR儀(QuantStudio?5為美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 組織實驗

1.2.1 qRT-PCR檢測宮頸組織FLCN mRNA表達(dá) 將收集的組織標(biāo)本移至用液氮預(yù)冷的研缽中，研磨勻漿，加入Trizol試劑提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR總反應(yīng)體系10 μL，包括SYBR Premix ExTaqⅡ 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板0.4 μL，其余部分用滅菌雙蒸水補(bǔ)充。循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 2 min，PCR擴(kuò)增95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達(dá)水平。引物序列如下，F(xiàn)LCN上游引物：5′-CCTCCTCTCTCTCAGGCTGT-3′，下游引物：5′-TGTATGGGATGATGCGGACG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGC-3′，下游引物：5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 免疫組化SP法檢測子宮頸組織中FLCN蛋白表達(dá) 蠟塊標(biāo)本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，烘片機(jī)中烘片30 min，常規(guī)脫蠟水化、抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉處理。加兔抗人FLCN 抗體(1 ∶200)，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；羊抗兔IgG(1 ∶200)室溫孵育30 min；PBS洗3次，DAB顯色及蘇木精復(fù)染。乙醇脫水干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍片。

FLCN表達(dá)主要位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，陰性對照組中無著色。參考文獻(xiàn)[4-5]免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)著色細(xì)胞百分比及細(xì)胞著色深淺分別計分判定結(jié)果：陽性細(xì)胞百分比<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；細(xì)胞著色深淺：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。兩項得分相乘即為綜合評分。

1.3 細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) SiHa細(xì)胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM，在37 ℃、含有5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，細(xì)胞呈貼壁生長。隔天換培養(yǎng)基，每2 d或待細(xì)胞密度達(dá)到70%以上傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 RNA干擾 細(xì)胞分為陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和實驗組(轉(zhuǎn)染FLCN siRNA-630)。轉(zhuǎn)染前將SiHa細(xì)胞按1.5×105個/mL接種于6孔板，待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行。siRNA序列如下，陰性對照 siRNA：正義鏈5′-ΜΜCΜCCGAACGΜGΜCACGΜTT-3′，反義鏈5′-ACGΜGACACGΜΜCGGAGAATT-3′；FLCN siRNA-630：正義鏈5′-GGGUGAGCAGGCGGAAGAATT′，反義鏈5′-UUCUUCCCGCCUGCUCACCCTT-3′。

1.3.3 瞬時轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分為空白對照組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)和實驗組(轉(zhuǎn)染FLCN-eGFP質(zhì)粒)操作同“1.3.2”。轉(zhuǎn)染6 h后換為完全培養(yǎng)基，48 h后行qRT-PCR。

1.3.4 qRT-PCR檢測SiHa細(xì)胞FLCN mRNA表達(dá)量 棄上述對照組及實驗組SiHa細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗1次，每10 cm2加入1～2 mL Trizol試劑，移液器反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，提取組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR總反應(yīng)體系及操作引物序列同“1.2.1”。

1.3.5 免疫熒光檢測PH3蛋白表達(dá) 將上述對照組及實驗組SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)種于放置有圓形玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行免疫熒光實驗。4%低聚甲醛固定20 min；含0.1% TritonX-100的PBS清洗3次，每次10 min；5%牛血清白蛋白封閉30 min；加入PH3一抗室溫孵育1 h；含0.1% TritonX-100的PBS清洗3遍；cy3標(biāo)記抗兔IgG(H+L)熒光二抗室溫孵育1 h；含0.1% TritonX-100的PBS清洗，去除多余二抗；加入100 μL 1.0 mg/mL的Hoechst33342染DNA 15 min；防熒光淬滅劑封片；用熒光顯微鏡采集SiHa細(xì)胞免疫熒光圖片，每幅圖像取3個不同視野，并根據(jù)陽性細(xì)胞率進(jìn)行分析。

1.3.6 CCK8檢測細(xì)胞增殖 將上述對照組及實驗組轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化；接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2.5×103個；分別于轉(zhuǎn)染后0 h、6 h、24 h、48 h加入10 μL CCK-8溶液，于孵箱內(nèi)避光孵育1 h；酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量，每個樣本做3個復(fù)孔。

1.3.7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染24 h后上述對照組及實驗組SiHa細(xì)胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行TUNEL檢測。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行試驗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)并拍照。用ImageJ記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 宮頸組織中FLCN mRNA和蛋白表達(dá)

子宮頸鱗癌組宮頸組織中FLCN mRNA表達(dá)明顯低于對照組(t=4.49，P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，對照組宮頸組織中FLCN蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)；而子宮頸鱗癌組宮頸組織中FLCN蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，表達(dá)強(qiáng)度較弱，見圖1。兩組間FLCN蛋白表達(dá)水平比較，F(xiàn)LCN在子宮頸鱗癌組中表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=7.04，P<0.01)。

圖1 FLCN mRNA和蛋白在兩組子宮頸組織中的表達(dá)

2.2 RNA干擾或轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后SiHa細(xì)胞中FLCN mRNA相對表達(dá)量

siRNA干擾后，SiHa細(xì)胞內(nèi)FLCN mRNA表達(dá)量相對于對照組降低約70%(t=6.64，P<0.05)；qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FLCN-eGFP質(zhì)粒48 h后，F(xiàn)LCN mRNA表達(dá)較空白對照組顯著升高(t=9.34，P<0.05)，見圖2。

圖2 SiHa細(xì)胞中FLCN mRNA相對表達(dá)水平

2.3 FLCN siRNA促進(jìn)SiHa細(xì)胞增殖，抑制SiHa細(xì)胞凋亡

與對照組相比，F(xiàn)LCN siRNA-630組中PH3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增多(t=4.47，P<0.05)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)LCN siRNA-630組細(xì)胞450 nm處光密度值在6 h、24 h及48 h 均明顯高于對照組(P均<0.01)，見圖3，由此表明，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。與對照組相比，F(xiàn)LCN siRNA-630組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(t=5.21，P<0.05)，見圖4。

2.4 FLCN過表達(dá)抑制SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡

與對照組相比，F(xiàn)LCN過表達(dá)組中PH3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(t=12.35，P<0.01)。CCK8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)LCN過表達(dá)組細(xì)胞450 nm處吸光度值在6 h、24 h及48 h均明顯低于對照組(P<0.05或<0.01)，見圖5，表明細(xì)胞增殖能力減弱。與對照組相比，F(xiàn)LCN過表達(dá)組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(t=59.55，P<0.01)，見圖6。

a:P<0.05，與同時間點陰性對照組比較

圖4 轉(zhuǎn)染FLCN siRNA-630后對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

FLCN基因是目前已知的唯一同時與各類腎細(xì)胞癌有關(guān)的基因[6]。FLCN除了與遺傳性腎癌密切相關(guān)外，還與結(jié)腸腫瘤[7]、嗜酸性腮腺瘤[8]和甲狀腺腫瘤[9]等相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在子宮頸鱗癌組織中，F(xiàn)LCN mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于正常宮頸組織，表明FLCN參與子宮頸癌的發(fā)展。

腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡由細(xì)胞內(nèi)外多個信號通路共同參與完成，其調(diào)控機(jī)制失常是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一[10]。Hasumi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腎臟細(xì)胞中，干擾FLCN蛋白表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SiHa細(xì)胞中FLCN mRNA表達(dá)，PH3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增加；反之上調(diào)FLCN mRNA表達(dá)，PH3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)減少，由此提示FLCN可抑制SiHa細(xì)胞增殖。凋亡是細(xì)胞正常程序性死亡過程，是調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞數(shù)量的一種生理機(jī)制，凋亡失衡是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的重要原因，而癌細(xì)胞的過度增殖對腫瘤的發(fā)展與惡化有促進(jìn)作用[12]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SiHa細(xì)胞中FLCN mRNA表達(dá)，TUNEL蛋白陽性細(xì)胞數(shù)減少；反之上調(diào)FLCN mRNA表達(dá)，TUNEL蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增加，由此提示FLCN可促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡；這與Piao等[13]針對小鼠肺泡上皮細(xì)胞研究結(jié)果一致。

a:P<0.05，b:P<0.01，與同時間點空白對照組比較

圖6 轉(zhuǎn)染FLCN質(zhì)粒后對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，F(xiàn)LCN基因可抑制SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明FLCN是子宮頸鱗癌的抑癌基因。但本研究僅從體外實驗研究細(xì)胞的增殖及凋亡，有一定的局限性，且其內(nèi)在的具體分子機(jī)制尚不明確，還需要更多的研究來闡述。