員亞晶，徐利曉，孫斌，馮星

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1.新生兒科，2.兒科研究所，江蘇 蘇州 215000)

Sox是由一類共同含有一個高度保守的高遷移率族框(high-mobility group box，HMG box)DNA結(jié)合域相關(guān)基因構(gòu)成的控制發(fā)育的基因。作為Sox基因家族中的一員, Sox2參與早期胚胎發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、基底細胞增殖分化等，是胚胎干細胞的表面分子標(biāo)志之一，在細胞的重編程中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。研究表明，Sox2在多種腫瘤中有著不同程度的表達，如乳腺癌[3]、胃癌[4]、鱗狀細胞癌[5]、前列腺癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7-8]、食道癌[9]和結(jié)直腸癌[10]等，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。RNA干擾技術(shù)能特異性地抑制基因在細胞中的表達。本研究通過沉默Sox2的表達來探索結(jié)直腸癌細胞SW620對其化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性之間的關(guān)系，為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌多細胞耐藥、增加其對化療藥物的敏感性提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株、質(zhì)粒及菌株

結(jié)直腸癌細胞株SW620購自中國科學(xué)院細胞庫，由蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)研究所保存。Sox2 shRNA干擾質(zhì)檢和對應(yīng)的空載對照購自Sigma公司。大腸埃希菌(DH5α)，包裝細胞293T，包裝質(zhì)粒pCM-VSV-G由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腫瘤與干細胞研究室惠贈。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、氨芐西林、嘌呤霉素、聚凝胺(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，細胞培養(yǎng)用胰酶(日本DAKO公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(美國Qiagen公司)、脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司),CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)，Sox2抗體(美國CST公司)，β-肌動蛋白抗體(美國Santacruz公司)，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(美國GE公司)。實驗所用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 轉(zhuǎn)染SW620細胞

轉(zhuǎn)染293T細胞獲得包裝病毒：1×105個細胞接種于6孔板中，正常條件培養(yǎng)；待細胞密度至60%時，無血清培養(yǎng)液饑餓處理2 h；Sox2基因干擾質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pCM-VSV-G共同經(jīng)Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入到包裝細胞293T中；轉(zhuǎn)染后48 h開始收集病毒液，0.45 μm濾膜過濾后直接使用或-80℃保存?zhèn)溆?。Sox2 shRNA慢病毒顆粒感染SW620細胞：1×105個細胞接種于6孔板中，正常條件下培養(yǎng)；第2天加入經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾的包含Lentivirus病毒顆粒培養(yǎng)液，加入8 μg/mL的聚凝胺增強病毒的感染力；12 h后去除病毒溶液，更換新鮮的培養(yǎng)液(如有必要，可再次感染)；感染48 h后，加入1 μg/mL的嘌呤霉素篩選沉默Sox2成功的細胞株；擴增耐藥的轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的細胞株，保存和用于其他功能研究。

1.4 實時熒光定量PCR檢測Sox2及ABC耐藥家族基因表達水平的變化

Sox2、ABC耐藥家族基因及β-肌動蛋白引物由Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

分別收集1×106個穩(wěn)定篩選的細胞，Trizol用于提取總RNA，NanoDrop2000分光光度儀測定RNA濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA模版，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增,反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 30 s；72℃收集熒光，共45個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后做相應(yīng)的溶解曲線，運用 LightCyler 480自帶的軟件進行實時數(shù)據(jù)收集和定量分析。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Sox2沉默效率

1×104個細胞接種于6孔板中，細胞密度至80%后，RIPA細胞裂解液用于總蛋白的提取，GE蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度?？偟鞍?00 μg，煮樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗Sox2和β-肌動蛋白4℃孵育過夜，二抗孵育，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光自顯影檢測。

1.5 免疫熒光檢測Sox2基因的沉默效率

1×104個Sox2沉默后細胞和對照組細胞接種于鋪了蓋玻片的6孔板中，待細胞密度至70%左右；冷的PBS沖洗后，4%低聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗滌3次，每次10 min，5% BSA-PBS封閉液室溫封閉1 h；棄去封閉液，加入1 ∶100稀釋的一抗，置于濕盒中4℃過夜；棄去一抗，PBS洗滌3次，每次10 min；加入帶有FITC標(biāo)記的1 ∶250稀釋的二抗，室溫避光孵育1 h；棄去二抗，PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI避光染色5 min，PBS洗滌3次，每次10 min；防淬滅甘油封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 CCK8法檢測干擾前后細胞對5-FU敏感性的變化

按5×103/孔將細胞接種于96孔板。每組分別加入終濃度為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 μg/mL的5-FU，以未加藥物的細胞為陰性對照，僅有培養(yǎng)液的孔作為校正，相同處理設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK8，37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔的光密度值。獨立實驗重復(fù)3次。計算各孔細胞的生長活力，繪制細胞生長活力曲線，以回歸方程求得5-FU對各細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.7 干擾前后5-FU誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的變化

按5×105/孔將細胞接種于6孔板中，每孔2.5 mL的培養(yǎng)基，24 h后，用含有終濃度10 μg/mL的5-FU培養(yǎng)液更換原有培養(yǎng)液，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)；24、48和72 h時收集樣品，加入終濃度為1 μg/mL的Hochest33342染色，熒光顯微鏡觀察拍照。同時收集樣品，用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞單克隆

嘌呤霉素梯度測試的結(jié)果顯示，一周后1 μg/mL嘌呤霉素處理的細胞全部死亡，因此確定嘌呤霉素1 μg/mL作為合適的shRNA穩(wěn)定表達細胞的藥物篩選濃度。經(jīng)1 μg/mL嘌呤霉素篩選得到單克隆，擴增培養(yǎng)。

2.2 干擾前后Sox2 mRNA的表達

轉(zhuǎn)染Sox2 shRNA兩組細胞中Sox2基因的表達較轉(zhuǎn)染對照載體組明顯降低，表明轉(zhuǎn)染抑制目的基因Sox2的表達(圖1)，轉(zhuǎn)染Sox2 shRNA clone1和Sox2 shRNA clone2的細胞組mRNA表達的抑制率約為40%和57%。

shRNA control：轉(zhuǎn)染空載的陰性對照組；shRNA clone1：轉(zhuǎn)染sox2干擾序列1的實驗組；shRNA clone1：轉(zhuǎn)染sox2干擾序列2的實驗組

圖1 實時熒光定量PCR檢測Sox2基因沉默的效率

2.3 干擾前后Sox2蛋白的表達

與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染了Sox2 shRNA clone1和Sox2 shRNA clone2的細胞中Sox2蛋白的表達水平顯著下降，見圖2。

A: 檢測轉(zhuǎn)染后Sox2蛋白表達水平；B: 對Sox2蛋白表達情況灰度分析；shRNA control:轉(zhuǎn)染空載的陰性對照組；shRNA clone1:轉(zhuǎn)染sox2干擾序列1的實驗組；shRNA clone1:轉(zhuǎn)染sox2干擾序列2的實驗組

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Sox2基因沉默的效率

2.4 免疫熒光檢測干擾前后Sox2的表達

轉(zhuǎn)染Sox2 shRNA 48 h后，用免疫熒光檢測兩組細胞Sox2基因的沉默效率，結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染了Sox2 shRNA clone1和Sox2 shRNA clone2的細胞與對照組細胞相比，熒光強度減弱，Sox2蛋白表達明顯降低。見圖3。

圖3 免疫熒光檢測Sox2基因沉默的效率

2.5 干擾前后細胞對5-FU敏感性的變化

10個不同濃度的5-FU處理各組細胞48 h后，檢測D(450 nm)值，分別計算各組細胞的生長活力和5-FU對細胞的IC50。結(jié)果表明，沉默Sox2后，SW620細胞對5-FU更加敏感，在5 μg/mL的5-FU處理48 h后細胞的存活率分別為39.15%和37.11%, IC50約為4.5 μg/mL。在對照組中，同樣的5 μg/mL的5-FU處理48 h后細胞的存活率為64.1%，遠遠高于沉默Sox2的實驗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0095和P=0.019)。見圖4。

圖4 Sox2沉默后SW620細胞對5-FU敏感性的變化

2.6 干擾前后5-FU誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的變化

用5-FU分別處理各組細胞24、48、72 h，Hoches33342染色觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組細胞相比，Sox2沉默后的細胞具有明顯的凋亡小體出現(xiàn)，并隨作用時間的延長凋亡小體增加。流式細胞儀檢測凋亡發(fā)現(xiàn)，Sox2 shRNA clone1和Sox2 shRNA clone2細胞在誘導(dǎo)不同時間點下的凋亡峰明顯高于對照組。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，在10 μg/mL的5-FU處理48 h后，對照組細胞的凋亡率為7.25%，而Sox2沉默組的凋亡率分別為23.97%和24.58%。見圖5。

A: Hochest33342染色觀察5-FU分別誘導(dǎo)24、48和72 h后干擾組和對照組細胞的凋亡情況(紅色箭頭所指為凋亡小體，白色箭頭所指為細胞核)；B: 流式細胞儀檢測5-FU分別誘導(dǎo)24、48和72 h后干擾組和對照組細胞的凋亡率；C：細胞凋亡率柱狀分析圖；#：P<0.05,*：P<0.01

圖5 Sox2沉默后5-FU誘導(dǎo)SW620細胞凋亡的變化

2.7 干擾前后ABC耐藥家族基因的表達

實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，ABC耐藥基因在Sox2敲除后表達量明顯下調(diào)，見圖6。

ABCA1、ABCB1、ACC1、ABCG1、ABCG2均為耐藥家族基因；#：P<0.05,*：P<0.01

圖6 Sox2沉默后SW620細胞耐藥基因的表達

3 討論

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率逐年增高，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌。目前大多采用以手術(shù)為主的綜合治療，手術(shù)后的5年生存率也僅為40%，放化療是臨床上治療結(jié)直腸癌和改善預(yù)后的重要手段之一，然而治療效果不盡人意。目前腫瘤化療的最大障礙來自于計量限制性毒性和腫瘤細胞產(chǎn)生的藥物耐受性，腫瘤細胞產(chǎn)生的耐受性，使得原本有效的治療方案變?yōu)闊o效。近年來人們對于結(jié)直腸癌等實體瘤的耐藥機制進行了大量的研究，結(jié)直腸癌耐藥機制涉及多方面，目前認(rèn)為，抵抗或者逃避化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡是腫瘤化療耐藥的重要機制之一。

耐藥是腫瘤細胞逃避化療藥物攻擊的最重要的防御機制，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性是提高治療成功率的關(guān)鍵，也是當(dāng)前研究的熱點。Sox2是重要的轉(zhuǎn)錄因子，本課題組前期的研究結(jié)果顯示Sox2在結(jié)直腸癌中高表達而在正常的腸道組織中呈弱陽性表達或者不表達。Sox2的表達與結(jié)直腸癌細胞的腫瘤分級、分化程度、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且影響結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移、浸潤侵襲和致瘤等多項生物學(xué)功能[10]。已有研究報道，在前列腺癌細胞DU145中過表達Sox2能增強DU145細胞對順鉑及毒胡蘿卜素的耐藥性，提示Sox2在前列腺癌細胞的耐藥復(fù)發(fā)中起到重要作用[6]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中，Sox2能夠通過上調(diào)多耐藥家族基因ABCC3和ABCC6的表達來提高腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。除此之外，在對內(nèi)源性高表達Sox2的細胞株LIN29進行Sox2的基因沉默后，顯著提高了細胞對BCNU, etoposide和staurosporine等抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的敏感性[11]。Shi等[12]研究指出，在對結(jié)直腸癌細胞進行誘導(dǎo)多功能干細胞(iPS)時發(fā)現(xiàn)，與正常的結(jié)直腸癌細胞相比，IPS球囊和親本細胞經(jīng)過化療藥物5-FU處理后，干細胞相關(guān)基因Nanog,Oct4,Sox2和Klf4的表達都明顯下調(diào)，說明5-FU處理能夠抑制干細胞相關(guān)基因的表達。以上研究提示Sox2的表達與腫瘤細胞的耐藥有關(guān)，但對其耐藥機制尚缺乏進一步的研究。

本研究證實，在對結(jié)直腸癌細胞SW620進行Sox2沉默表達之后，經(jīng)過嘌呤霉素的篩選，采用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法及免疫熒光檢測結(jié)果均表明Sox2的表達受到抑制，通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)干擾Sox2后SW620細胞對5-FU的敏感性大大提高，細胞凋亡數(shù)量明顯增加。

腫瘤細胞的耐藥機制之一是通過細胞膜上面ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族等藥物泵將藥物從細胞內(nèi)泵出到胞外，從而使藥物不能與腫瘤細胞接觸,逃脫多種化療藥物的毒性和殺傷作用。ABC轉(zhuǎn)運蛋白是多耐藥家族的重要成員，在體內(nèi)廣泛分布，主要包括有 ABCBl編碼的 P-糖蛋白、ABCCl編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白、ABCG2編碼的乳腺癌耐藥蛋白[13]。在CD133+的結(jié)直腸癌干細胞中ABCG2等ABC家族蛋白介導(dǎo)細胞膜上的膜泵耐藥分子將細胞質(zhì)中的藥物清除，對化療藥物具有很強的抵抗能力[14]。我們進一步對干擾前后SW620細胞中多耐藥家族基因的表達水平進行實時熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因ABCG1,ABCG2, ABCB1, ABCC1, ABCA1等耐藥基因在 Sox2沉默細胞中表達量下調(diào)，推測Sox2可能通過調(diào)節(jié)耐藥基因的表達參與結(jié)直腸癌的耐藥過程，提示Sox2可能成為結(jié)直腸癌治療的一個潛在靶點。

綜上所述，本研究首次報告Sox2與結(jié)直腸癌細胞的耐藥性相關(guān)，沉默Sox2后能夠逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細胞SW620對化療藥物 5-FU的耐受性，為進一步闡明結(jié)直腸癌耐藥性的分子機制提供了實驗依據(jù)，為臨床上研制腫瘤藥物和制定治療方案提供了新的靶點，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。