熊昌艷，李雪嬌，黃新祥

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類致病菌，多種毒力基因的作用可引起輕度腹瀉甚至是嚴重的全身性感染[1]。傷寒沙門菌在感染過程中通過調(diào)節(jié)毒力基因的表達而迅速適應環(huán)境的變化。傷寒沙門菌的致病過程很復雜，涉及相關基因的活化和抑制以適應新的環(huán)境[2]。此外，各類調(diào)節(jié)因子，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory systems，TCSs)，蛋白修飾水解酶和σ因子等均參與了致病過程[3]。近年來隨著研究的深入，和大腸埃希菌一樣，傷寒沙門菌已成為重要的模式生物，其對環(huán)境應答的基因表達，特別是與宿主作用的毒力因子的表達調(diào)節(jié)網(wǎng)絡機制，已成為研究的熱點。

許多非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)通過多種機制參與調(diào)節(jié)不同生物過程中相關基因的表達[4-5]。本實驗室應用深度測序分析發(fā)現(xiàn)了數(shù)個細菌中的ncRNAs[6-8]，其中包括與rpoHmRNA互補的順式編碼ncRNA ArpH[9]。本研究利用RNA印跡和qRT-PCR等技術，對ArpH在不同生長時期和不同應激條件下的表達、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和氧應激調(diào)節(jié)因子對其調(diào)控作用進行分析，以期探討ArpH在傷寒沙門菌致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

傷寒沙門菌GIFU 10007、ompR缺陷株(ΔompR)、rcsB缺陷株(ΔrcsB)和oxyR缺陷株(ΔoxyR)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與材料

酵母提取物、胰蛋白胨粉(英國Oxoid公司)；NaCl、NaOH、HCl、無水乙醇、異丙醇、枸櫞酸鈉、EDTA-Na2·2H2O(國藥集團上海化學試劑公司)；特異性引物和探針(蘇州泓迅生物科技有限公司)；DIC Northern試劑盒(瑞士Roche公司)；HybondTM-N+尼龍膜(美國GE Healthcare公司)；RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)；PrimeScript反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3 主要儀器

PCR儀2720 Thermal Cycler(美國ABI公司)；瓊脂糖電泳儀(南京新校園生物技術研究所)；Northern核酸雜交儀(英國Roller-Blot公司)；熒光定量PCR儀CFX96TMReal-Time System和PAGE凝膠電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.4 細菌培養(yǎng)和總RNA提取

挑取單克隆細菌于LB液體37℃過夜培養(yǎng)，按1 ∶100轉接于相同條件LB液體培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)至不同生長時期[D(600 nm)為0.3、0.8、1.3和2.0分別代表對數(shù)早期、對數(shù)期、對數(shù)晚期和穩(wěn)態(tài)期]，收集細菌。采用TRIzol法提取細菌總RNA后，用2 μL(1 U/μL)DNA酶Ⅰ 37℃ 30 min、1 μL(1 U/μL)DNA酶Ⅰ 80℃ 2 min去除混雜的少量DNA，酚仿-乙醇法純化。取適量RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

將傷寒沙門菌培養(yǎng)至對數(shù)期后分別給予酸、高滲、氧應激培養(yǎng)30 min和42℃熱應激(10、20、30 min)，分別收集細菌，上述方法提取RNA。酸應激組細菌添加濃鹽酸，使最終pH=4.5；高滲應激組添加5 mol/L的NaCl溶液1.06 mL；氧應激組添加30%的H2O210 μL；對照組不做處理。

1.5 RNA印跡檢測ArpH RNA表達

用ArpH特異性cDNA探針檢測ArpH。利用Oligo 6軟件，根據(jù)arpH的核苷酸序列設計RNA印跡探針ArpH-NR(5′-AGGGCGATCTGGAAGCAGCT-AAAACGCTGATCCTGTCTCACCTGCGCTTTGTTG-3′)。5S rRNA為內(nèi)參(5S-NR：5′-CTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCA-GGTGGGA-3′)。取200 ng純化的探針DNA用DIC Northern試劑盒體外轉錄并標記探針。反應完成后加入1 μL(10 U/μL)DNA酶Ⅰ 37 ℃消化30 min，2 μL 0.2 mol/L EDTA終止反應。加入DEPC水使總體積達到50 μL。加入1/10體積的5 mol/L乙酸銨和3倍體積預冷的無水乙醇，-20 ℃放置2 h，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，75%乙醇漂洗，空氣干燥。用50 μL DEPC水溶解，應用核酸檢測儀檢測探針濃度；應用10%的尿素變性PAGE電泳檢測探針質(zhì)量。剩余探針加入20 U RNA酶抑制劑，-80 ℃保存待用。在含有7 mol/L尿素的6%聚丙烯酰胺凝膠上分離出10～20 μg總RNA，并電印跡到HybondTMN+尼龍膜上(300 mA 40 min)。轉膜完成后用2×SSC洗膜2次。80 ℃干燥2 h，固定RNA。膜固定后，用DEPC水洗膜3次，加入5 mL Rhoche雜交液，55 ℃預雜交1 h。棄去雜交液，加入5 mL新的雜交液，將探針90 ℃變性后添加到雜交液中過夜。次日洗膜并孵育地高辛抗體，用化學發(fā)光凝膠成像儀曝光顯影。

1.6 qRT-PCR檢測ArpH RNA表達

利用Oligo 6軟件，根據(jù)arpH的核苷酸序列設計特異性引物RT-PA(5′-CTCATCGTCCGAAGACAT-3′)和RT-PB(5′-CGTTAAAGTCGCAACCAC-3′)。5S rRNA為內(nèi)參(5S-A：5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′；5S-B：5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′)。提取不同生長時期和不同應激(酸、氧、高滲)條件下的細菌總RNA各4 μg，用隨機引物將RNA反轉錄成cDNA，再以ArpH RT-PA/RT-PB進行qRT-PCR。使用qRT-PCR儀監(jiān)測反應，并使用2-ΔΔCT方法進行標準化[10]。

將傷寒沙門菌培養(yǎng)至對數(shù)期后分別給予42 ℃熱應激10、20、30 min，提取不同時間段RNA做qRT-PCR。選擇ompR、rcsB和oxyR基因缺陷變異株培養(yǎng)至生長對數(shù)期，提取RNA后消化殘余DNA，用隨機引物反轉錄成cDNA后進行qRT-PCR。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同生長期傷寒沙門菌ArpH的表達

qRT-PCR結果顯示(圖1A)，ArpH在細菌生長的對數(shù)晚期時表達量最高，從對數(shù)早期到對數(shù)晚期的過程中，表達量逐漸增加，而進入穩(wěn)態(tài)期后有所回落。

RNA印跡結果顯示(圖1B)，ArpH在對數(shù)晚期條帶最濃，對數(shù)早期條帶最淡，與定量結果一致。

A: 實時定量PCR；B: RNA印跡

2.2 酸、高滲、氧應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

RNA印跡(圖2A)和qRT-PCR(圖2B)結果顯示，ArpH表達水平在酸應激下明顯下降(P<0.01)，氧應激下明顯增高(P<0.01)，而高滲應激下則無明顯變化。

A: RNA印跡；B: 實時定量PCR

2.3 熱應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

如圖3所示，42℃熱應激10、20、30 min對ArpH表達無明顯影響(F=1.066，P=0.430 9)。

圖3 熱應激下傷寒沙門菌ArpH的表達

2.4 ompR、rcsB和oxyR基因?qū)抽T菌ArpH表達的影響

qRT-PCR結果顯示，ompR、rcsB和oxyR基因缺失時，傷寒沙門菌ArpH表達量均明顯下調(diào)(圖4)。

*：P<0.01，與野生株比較

3 討論

ncRNA對細菌適應特定生長環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用[11]。沙門菌和其他細菌一樣，擁有一套適應環(huán)境的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許它在感染動物的每個階段的惡劣環(huán)境下進行繁殖。例如被攝取后，沙門菌必須首先應對溫度升高之后胃的酸性環(huán)境，在腸內(nèi)又受到滲透壓增加、氧分壓降低等因素影響，以及與腸道正常菌群的競爭[12]。沙門菌隨后可以進入非吞噬細胞和吞噬細胞并在其中增殖，細菌抵抗細胞內(nèi)防御，該過程涉及抗菌肽、含沙門菌液泡的酸化、活性氧和氮的產(chǎn)生等機制。為了應對這些應激條件，傷寒沙門菌必須快速調(diào)節(jié)其轉錄前體，這可能與ncRNA介導的快速基因調(diào)節(jié)有關。監(jiān)測ncRNA表達可以揭示與沙門菌在宿主細胞內(nèi)生存策略相關的誘導模式[13]。

隨著arpH基因位置的確定[9]，本研究進一步分析了ArpH的表達特性，結果顯示ArpH在細菌生長的對數(shù)晚期表達量最高，從對數(shù)早期到對數(shù)晚期的過程中，表達量逐漸增加，而進入穩(wěn)態(tài)期后有所回落。這表明ArpH可能在傷寒沙門菌生長的對數(shù)晚期發(fā)揮了重要作用。

本研究在體外模擬了傷寒沙門菌感染人體時可能遭遇胃酸、高滲腸道液及吞噬細胞內(nèi)活性氧這3種不同的應激環(huán)境，RNA印跡和qRT-PCR結果顯示，ArpH表達水平在酸應激下明顯下降，氧應激下明顯增高，而高滲應激下則無明顯變化。這提示細菌可能通過下調(diào)ArpH的水平來參與傷寒沙門菌對酸的應激。而在氧應激下，ArpH表達上調(diào)有助于細菌在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用。

在暴露于熱應激后，幾乎所有生物體的細胞瞬時增加了一組熱休克蛋白(heat shock proteins，hsps)的合成，這些分子通常是分子伴侶和蛋白酶。這種反應稱為熱休克反應，最大限度地減少了熱變性和蛋白質(zhì)聚集所造成的損害。大腸埃希菌的RNA聚合酶含有σ32(rpoH的基因產(chǎn)物)，它參與了許多熱休克蛋白基因的轉錄。有實驗表明當溫度從30°C突然升至42°C時，6 min后σ32的水平增加了約17倍，15 min后下降至5倍[14]。arpH基因定位圖顯示ArpH完全覆蓋了rpoH的編碼區(qū)，提示rpoH可能是ArpH的靶基因[9]。因此，我們探討了熱應激不同時間ArpH的表達水平。結果表明熱應激并未影響ArpH的表達。上述結果表明ArpH可能并不參與熱應激時rpoH的表達調(diào)控。但在其他高溫或低溫情況下是否發(fā)揮作用尚待進一步研究。

細菌的基因表達還可受各種調(diào)節(jié)(蛋白)因子的影響。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)由位于細菌胞膜上的感受蛋白和胞內(nèi)效應調(diào)節(jié)蛋白構成，在各種應激環(huán)境的基因表達調(diào)節(jié)中至關重要。感受蛋白多為ATP依賴性蛋白激酶，在外部環(huán)境的刺激下，胞內(nèi)近C末端的組氨酸殘基可磷酸化，然后再將磷酸基團特異性地傳遞給胞內(nèi)特殊的調(diào)節(jié)蛋白天門冬氨酸殘基，使其磷酸化并改變蛋白構象及活性，從而影響對相關基因的轉錄表達[15]。OmpR與EnvZ構成雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，除調(diào)節(jié)膜通道蛋白OmpC和OmpF表達外，還與沙門菌SPI-1和SPI-2基因表達調(diào)節(jié)有關[16]。本研究分析了傷寒沙門菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(OmpR、RcsB)和氧應激調(diào)節(jié)因子OxyR對ArpH的影響。實驗結果表明，當ompR、rcsB和oxyR基因缺失時，ArpH表達量均明顯下調(diào)，表明傷寒沙門菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)OmpR、RcsB和氧應激調(diào)節(jié)因子OxyR對ArpH均有正向調(diào)控作用。

綜上所述，本研究初步探討了傷寒沙門菌在不同生長時期和不同應激條件下ncRNA ArpH的表達特性。結果提示ArpH參與了傷寒沙門菌對酸、氧應激的調(diào)節(jié)；雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)OmpR、RcsB和氧應激調(diào)節(jié)因子OxyR對ArpH均有正向調(diào)控作用。本研究為進一步深入探討ArpH的作用機制提供了基礎。