孫旭杰，王慧穎，侯磊，閆舒，張菊，蔣俊

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

為達(dá)到漂白、防霉、防蟲等目的，硫磺熏蒸后的中藥在市場(chǎng)上廣泛流通[1]。從毒理學(xué)上來(lái)說(shuō)，硫磺可引起眼結(jié)膜炎、皮膚濕疹等疾病，且對(duì)皮膚有弱刺激性[2]。研究表明，硫熏工藝不僅改變了中藥的化學(xué)成分[3]，也降低了中藥的抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種功能[4, 5]，甚至誘發(fā)了血小板、肝臟、腎臟等多種損傷[6-10]。目前，中藥的硫磺熏蒸問(wèn)題已經(jīng)引起了行業(yè)內(nèi)的高度關(guān)注，硫熏菊花相關(guān)研究報(bào)道也屢見不鮮。

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，能清熱解毒，用于風(fēng)熱感冒、瘡癰腫毒等[11]，其揮發(fā)油類成分含量在0.57%～4.95%[12-13]?，F(xiàn)代研究表明，菊花揮發(fā)油對(duì)白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用[14]，還具有抗炎[15]、降壓[16]等作用。硫磺熏蒸后的菊花會(huì)造成咽喉疼痛、胃部不適等不良反應(yīng)[17]。硫磺熏蒸誘導(dǎo)黃酮苷類化合物經(jīng)水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為苷類化合物[18]；菊花經(jīng)過(guò)硫熏之后因成分變化而影響其入腸吸收[19]，同時(shí)抗氧化應(yīng)激作用減弱[20-21]。目前，如何快速準(zhǔn)確地鑒別出硫熏菊花仍然是一個(gè)技術(shù)難題。2015版《中國(guó)藥典》中采用酸堿滴定法檢測(cè)二氧化硫殘留量[22-23]，但是藥材中殘留的二氧化硫會(huì)隨著貯藏時(shí)間不斷減少,可達(dá)50%[24]。本研究以菊花為例，探究其硫熏前后揮發(fā)油類成分的變化，篩查硫熏特征成分，為硫熏菊花的質(zhì)量控制及其硫熏品鑒別檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

電熱套、揮發(fā)油提取器、球形冷凝管、蒸發(fā)皿、2號(hào)篩(江蘇朋來(lái)生物科技有限公司)；十萬(wàn)分之一天平(精華科技儀器有限公司)；干燥器；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器公司)；Agilent7693型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；菊花(經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院伍成穎副研究員鑒定為菊科植物ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序)；升華硫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他物質(zhì)均為分析純。

2 樣品的制備

2.1 非硫熏菊花的前處理

取菊花100 g，適量噴水并攪拌，使之得到均勻潤(rùn)濕，30 min后，40℃烘干，粉碎過(guò)2號(hào)篩，得到非硫熏菊花樣品，備用。

2.2 硫熏菊花的制備

稱取菊花樣品200 g，以適量水潤(rùn)濕30 min后，置于干燥器的上層，下層點(diǎn)燃藥材量20 %的升華硫，密閉，待硫磺燃盡后取出，烘干(<40℃)，粉碎過(guò)2號(hào)篩，得到菊花硫熏樣品，備用。

2.3 揮發(fā)油的提取

水蒸氣蒸餾法：稱取藥材粉末100 g至圓底燒瓶中，燒瓶上接揮發(fā)油提取器，待停止出油為止，靜置取出，無(wú)水Na2SO4脫水，4℃避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 菊花硫熏前后揮發(fā)油類成分的GC-MS/MS解析

2.4.1 氣相色譜條件 Agilent7693型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱為DB-5MS，載氣為He，流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，輔助加熱器溫度為250 ℃。程序升溫，升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，維持10 min；以5 ℃/min升至150℃，保持6 min；再以5 ℃/min升至200 ℃，保持6 min；然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；以10 ℃/min的速度升至300 ℃，保持10 min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電離源70 eV，采集方式：選擇離子掃描模式，離子源溫度為230 ℃，加速電壓200 eV，掃描質(zhì)量范圍(m/z)為50～800。在NIST-08數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步匹配以確定揮發(fā)油的成分。根據(jù)所得色譜峰數(shù)據(jù)，面積歸一化法算出所得菊花硫熏前后的揮發(fā)油中的各個(gè)成分的相對(duì)含量。

3 結(jié)果

3.1 菊花硫熏前后揮發(fā)油的性狀與產(chǎn)率

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)：硫熏前，菊花的揮發(fā)油提取率為0.20%、呈現(xiàn)淺綠色且具有香味；硫熏后降至0.15%、呈現(xiàn)黃色且有刺鼻的硫磺味。初步判斷硫熏前后揮發(fā)油性狀的變化由硫磺熏蒸后殘留的未知成分如二氧化硫及其衍生物造成。

3.2 菊花硫熏前后揮發(fā)油類成分的GC-MS/MS解析

從非硫熏與硫熏菊花揮發(fā)油中分別檢測(cè)出242、261個(gè)色譜峰，如圖1所示，其中非硫熏組與硫熏菊花揮發(fā)油篩選含有的成分分別有201、227個(gè)，非硫熏組揮發(fā)油鑒定含有的成分有桉樹素、樟腦、內(nèi)式-龍腦、百里酚、葉綠醇、香葉基異丙基苯、β-金合歡烯、石竹烯、水芹烯、β-甜沒(méi)藥烯、順-澳白檀醇、香芹酮、馬兜鈴烯、2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)-二環(huán)[3.1.1]庚二烯、2-(2,4-己二烯基)-1,6-二氧雜螺[4.4]非-3-烯、P-薄荷1,5-二烯-8醇、順-p-薄荷-2,8-二烯-1-醇、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基-萘、乙酸桃金娘烯酯、異戊酸龍腦酯、1-(1-丁烯-3-基)-2-乙烯基-苯、(1S,內(nèi))1,7,7-三甲基醋酸酯二環(huán)[2.2.1]庚烷-2-醇、(9S,10R)-9,10-環(huán)氧-3Z,6Z-二十一碳二烯等共26個(gè)。

硫熏組鑒定含有的成分有桉樹素、樟腦、內(nèi)式-龍腦、百里酚、葉綠醇、香葉基異丙基苯、α-松油醇、(1S,3R,6R)-(-)-4-蒈烯、α-杜松醇、蓽澄茄油萜、氧化香橙烯、脫氫香橙烯、9,10-脫氫-異長(zhǎng)葉烯、1-甲基-8-(1-甲基乙基)-三環(huán)[4.4.0.0(2,7)]dec-3-烯-3-甲醇、5,7-二乙基-5,6-癸二烯-3-炔等共21個(gè)。

圖1 非硫熏菊花揮發(fā)油與硫熏后菊花揮發(fā)油GC-MS/MS總離子流圖

通過(guò)GC-MS/MS條件分析硫熏與非硫熏菊花揮發(fā)油成分，從非硫熏組、硫熏組菊花揮發(fā)油中經(jīng)鑒定篩選出201、227個(gè)化學(xué)成分，其中硫熏與非硫熏菊花揮發(fā)油共有的化學(xué)成分有27個(gè)，分別占27.75%、32.73%，見表1。

共有成分主要有桉樹素、樟腦、內(nèi)式-龍腦、1,3-二嗪、(1S,內(nèi))1,7,7-三甲基醋酸酯、7-亞甲基-二環(huán)[4.1.0]庚烷、N,N,2-三苯基-咪唑二胺、[S-(R*,S*)]-3-(1,5-二甲基-4-己烯)-6-亞甲基-環(huán)己烯，占非硫熏與硫熏菊花揮發(fā)油總量的22.06%、19.69%。

如表1所示，通過(guò)對(duì)比可知，經(jīng)過(guò)硫熏后，很多菊花揮發(fā)油成分的含量大幅度減少了，比如桉樹素、樟腦、內(nèi)式-龍腦等，這說(shuō)明硫熏處理可導(dǎo)致菊花有效成分含量減少，進(jìn)而影響菊花的功效。

3.3 硫熏后新出現(xiàn)的成分

通過(guò)對(duì)比非硫熏組與硫熏組中菊花揮發(fā)油成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫熏后出現(xiàn)了硫熏前不含有的成分，如表2所示，共72個(gè)，占總量的54.95%。

3.4 硫熏后消失的成分

通過(guò)對(duì)比非硫熏組與硫熏組菊花揮發(fā)油成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫熏前含有的部分成分經(jīng)過(guò)熏蒸后消失了，如表3所示，消失的成分共50個(gè)，占56.89%。其中，水芹烯、石竹烯、β-金合歡烯、順-p-薄荷-2，8-二烯-1-醇、異戊酸龍腦酯、β-甜沒(méi)藥烯、順-澳白檀醇、淫羊藿醇、香芹酮共占8.06%。

3.5 初步判斷硫熏后產(chǎn)生的成分

可以初步判斷硫熏后產(chǎn)生的含硫成分有35個(gè)，部分新含硫化學(xué)成分見表4。

表1 硫熏與非硫熏菊花揮發(fā)油共有成分

(續(xù)表1)

表2 硫熏后新出現(xiàn)的成分

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

表3 硫熏后消失的成分

表4 硫熏后新化學(xué)成分推斷列表

4 討論

本研究首次利用GC-MS分析非硫熏與硫熏菊花揮發(fā)油類成分，發(fā)現(xiàn)菊花在硫熏過(guò)程中存在化學(xué)成分的轉(zhuǎn)歸，菊花經(jīng)過(guò)硫磺熏蒸后，不僅菊花粉末的顏色、香味和質(zhì)地均發(fā)生了明顯變化，而且揮發(fā)油的顏色、氣味以及揮發(fā)油的提取率也受到了影響。樣品經(jīng)GC-MS/MS解析后發(fā)現(xiàn)，菊花經(jīng)硫磺熏蒸后揮發(fā)油類成分含量部分有所下降或者成分消失，但也出現(xiàn)了一些新的含硫成分，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，未硫熏樣品中幾乎不含硫，而經(jīng)硫磺熏蒸后，含硫成分明顯增加。

硫磺熏蒸后的中藥材,能較好地防蟲防霉,改善中藥材的外觀顏色,增加成品的色澤美感,在中藥材的貯藏運(yùn)輸和提高商品價(jià)值等方面具有較大優(yōu)勢(shì)。然而,硫磺熏蒸中藥材中有害物質(zhì)的殘留對(duì)中藥材品質(zhì)、臨床療效及人體健康均造成極大影響與危害。從中藥材的“安全”原則來(lái)看,硫磺熏蒸缺點(diǎn)遠(yuǎn)大于優(yōu)點(diǎn)。

菊花中化學(xué)成分復(fù)雜，通過(guò)對(duì)比可知，經(jīng)過(guò)硫熏后，很多菊花揮發(fā)油成分的含量大幅度減少，比如桉樹素、樟腦、內(nèi)式-龍腦等，硫熏處理可導(dǎo)致菊花有效成分含量減少，也有新的成分產(chǎn)生，具體機(jī)制尚不明確，菊花經(jīng)硫熏之后，導(dǎo)致其他多種成分的復(fù)雜變化,臨床藥理和毒理作用也將發(fā)生改變。本研究不足之處主要在于未涉及硫熏菊花的相關(guān)藥理、毒理方面的實(shí)驗(yàn)，因此,后續(xù)將進(jìn)一步分析菊花硫熏前后的化學(xué)成分組分結(jié)構(gòu)差異性以及這些差異帶來(lái)的藥理及毒理的影響,并根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)一步探索更為確實(shí)有效的硫磺熏蒸菊花的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為中藥材和中藥飲片市場(chǎng)的規(guī)范化提供技術(shù)支撐。