王彩虹，潘曉嫻，陳金梅，黃菲，吳建東，洪金省

(1.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350005；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，福建 福州 350005；3.放射生物福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；4.福建省個(gè)體化主動免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；5.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005)

隨著惡性腫瘤綜合治療的廣泛應(yīng)用和精確放射治療技術(shù)的日益發(fā)展，放射治療已成為胸部腫瘤(如肺癌、食管癌、乳腺癌等)治療的重要手段。放射性肺損傷是胸部放射治療的常見并發(fā)癥[1-4]，早期表現(xiàn)為急性和亞急性放射性肺炎，后期發(fā)展為肺纖維化。放射性肺纖維化(radiation-induced pulmonary fibrosis, RIPF)是胸部腫瘤放療的主要劑量限制性毒性反應(yīng)，其發(fā)生率可高達(dá)86%[5]。RIPF一旦發(fā)生就難以逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響著放療效果及生活質(zhì)量，甚至可能導(dǎo)致死亡。然而，目前RIPF的確切機(jī)制尚未明確，臨床上缺乏有效的治療方法。

放射性免疫功能紊亂是放射性損傷的驅(qū)動因素[6]。大量研究已證實(shí)放射性肺損傷過程中伴隨著多種免疫細(xì)胞、免疫因子的動態(tài)變化及相互作用[7]。其中，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠識別自身和外來的抗原，抑制炎癥反應(yīng)并減少炎癥對組織帶來的損傷，維持機(jī)體耐受和自身免疫的平衡。近些年來，Treg細(xì)胞在肺纖維化中的作用備受關(guān)注。研究表明，Treg細(xì)胞在特發(fā)性纖維化[8-9]、矽肺[10-12]和博萊霉素[13]等不同因素所致肺纖維化中表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律、發(fā)揮著不同的作用。Xiong等[14]研究顯示，小鼠胸部照射后，外周血和肺組織中Treg細(xì)胞均明顯增多，Treg細(xì)胞具有促進(jìn)RIPF的作用。脾臟作為機(jī)體最大的免疫器官和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的中心，擁有全身循環(huán)T淋巴細(xì)胞的25%，直接參與細(xì)胞免疫，并對外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的分布具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究分析了小鼠RIPF過程中脾臟、外周血和肺組織中Treg細(xì)胞的動態(tài)變化，以期為深入研究Treg細(xì)胞在RIPF的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

80只8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠，體重19～22克，購于上海斯萊克動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。本研究采用2×4析因設(shè)計(jì)方法，隨機(jī)方式分成對照組和照射組，每組又隨機(jī)分為4個(gè)小組(分別于照射后2天、17天、3個(gè)月和5個(gè)月進(jìn)行研究觀察)。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只小鼠。

1.2 照射方法

將小鼠用4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，分別置于自制的有機(jī)玻璃鼠籠內(nèi)，用凹形卡槽固定小鼠的頸部，充分拉伸小鼠身體后用膠布固定其尾部。將照射組小鼠分批進(jìn)行照射，每批8只排列于治療床上，經(jīng)電子射野影像系統(tǒng)驗(yàn)證體位以確保小鼠肺部于照射野內(nèi)后，予直線加速器(Varian，Clinac600C/D)的6 MV X線全肺單次照射15 Gy(照射角度0°，射野38 cm × 1.2 cm,劑量率300 cGy/min,源皮距為100 cm)，具體擺位方法參考已發(fā)表的論文[15]。

1.3 標(biāo)本取材

分別于照射后2天(急性炎癥期)、17天(亞急性炎癥期)、3個(gè)月(纖維化前期)和5個(gè)月(纖維化期)，各組取10只小鼠，先用眼球取血法取外周血約1 mL置抗凝管中備用，再將小鼠用頸椎脫臼法處死取肺組織和脾臟。其中，左肺用于病理檢測，外周血、右肺和脾臟用于Treg細(xì)胞的檢測。

1.4 RIPF模型的病理驗(yàn)證

將小鼠左肺以10%福爾馬林固定、乙醇脫水、石蠟包埋，連續(xù)3.5 μm的厚度切片，行HE染色和Masson染色后通過光學(xué)顯微鏡觀察。采用Image J軟件對Masson染色結(jié)果中所示的肺間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行分析，用膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction ,CVF)代表肺纖維化程度，CVF=膠原面積/(圖像總面積-空白區(qū)域面積)。

1.5 Treg細(xì)胞的檢測

1.5.1 樣品的制備 ① 外周血：將外周血2 000 r/min離心8 min，取血細(xì)胞100 μL，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液吹打混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)2次；再用5 mL PBS吹打混勻,2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；用100 μL PBS重懸。② 肺組織：將右肺組織置于50 mL離心管中，研磨過濾，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入5 mL紅細(xì)胞裂解液吹打混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；再用5 mL PBS吹打混勻,2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；用100 μL PBS重懸。③ 脾臟：將脾臟置于50 mL離心管中，研磨過濾，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入5 mL紅細(xì)胞裂解液吹打混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；再用5 mL PBS吹打混勻,2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；用500 μL PBS重懸，每管取20 μL，并用100 μL PBS稀釋。

1.5.2 抗體染色與流式細(xì)胞儀檢測 將以上制備好的外周血、肺組織和脾臟的單細(xì)胞懸液，按小鼠Treg細(xì)胞染色試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)說明書的步驟進(jìn)行染色后，用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠RIPF模型的病理驗(yàn)證

2.1.1 HE染色 照射后第2天、17天，C57BL/6小鼠的肺泡腔及肺泡間隔可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；照射后3個(gè)月、5個(gè)月，肺泡間隔進(jìn)一步增厚，肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎陷、融合、變形(圖1)。對照組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 小鼠胸部照射后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織的HE染色(×100)

2.1.2 Masson 染色 對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無明顯膠原纖維沉積。照射后5個(gè)月，照射組小鼠的肺泡間隔可見大量膠原沉積(圖2)。照射后5個(gè)月照射組小鼠肺組織的CVF(65.67%±9.53%)較對照組(13.28% ± 2.27%)明顯增高(t=16.044,P<0.01)。

圖2 小鼠胸部照射后5個(gè)月肺組織的Masson染色(×100)

2.2 Treg細(xì)胞的變化情況

2.2.1 外周血 經(jīng)兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，小鼠外周血中Treg/CD4+T細(xì)胞比例在是否照射(F=42.78，P<0.01)和照射后不同時(shí)間點(diǎn)(F=143.5，P<0.01)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。照射后2天(t=6.854,P<0.01)，17天(t=12.96,P<0.01)小鼠外周血中Treg/CD4+T細(xì)胞比例均較對照組升高，而照射后3個(gè)月和5個(gè)月時(shí)較對照組無顯著差異(P>0.05)。照射組從照射后2天開始Treg/CD4+T細(xì)胞比例明顯升高，在17天達(dá)高峰(t=6.978,P<0.01)，3個(gè)月則較17天時(shí)明顯下降(t=12.21,P<0.01)并恢復(fù)至對照組水平，5個(gè)月時(shí)則維持穩(wěn)定。對照組各時(shí)間點(diǎn)間無顯著差異(F=0.475，P>0.05)。見圖3。

2.2.2 肺組織 經(jīng)兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，小鼠肺組織中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例在是否照射(F=100.7，P<0.01)和照射后不同時(shí)間點(diǎn)(F=234.4，P<0.01)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。照射后2天(t=18.56,P<0.01)，17天(t=21.08,P<0.01)小鼠肺組織中Treg/CD4+T細(xì)胞比例均較對照組升高，而照射后3個(gè)月和5個(gè)月時(shí)較對照組無明顯差異(P>0.05)。照射組從照射后2天開始Treg細(xì)胞比例明顯升高，17天達(dá)高峰，3個(gè)月則明顯下降(t=17.92,P<0.01)，5個(gè)月時(shí)則維持穩(wěn)定并恢復(fù)至對照組水平。對照組各時(shí)間點(diǎn)間則無顯著差異(F=0.232，P>0.05)。見圖4。

a：與對照組比較，P<0.01；b：與照射后2天比較，P<0.01；c：與照射后17天比較，P<0.01

圖3 小鼠胸部照射后不同時(shí)間點(diǎn)外周血中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例

a：與對照組比較，P<0.01；b：與照射后17天比較，P<0.01

圖4 小鼠胸部照射后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例

2.2.3 脾臟 經(jīng)兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，小鼠脾臟中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例在是否照射(F=63.98，P<0.01)和照射后各時(shí)間點(diǎn)(F=132.8，P<0.01)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。照射后2天(t=10.09,P<0.01)，17天(t=13.87,P<0.01)和3個(gè)月(t=8.493,P<0.01)小鼠脾臟中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例均較對照組明顯升高，照射后5個(gè)月較對照組明顯下降(t=6.003,P<0.01)。從照射后2天開始Treg細(xì)胞比例明顯升高，17天達(dá)高峰，3個(gè)月較17天明顯下降(t=5.203,P<0.01)，5個(gè)月時(shí)進(jìn)一步下降且明顯低于3個(gè)月水平(t=14.19,P<0.01)。對照組各時(shí)間點(diǎn)間無顯著差異(F=0.526，P>0.05)。見圖5。

a：與對照組比較，P<0.01；b：與照射后17天比較，P<0.01；c：與照射后3個(gè)月比較，P<0.01

圖5 小鼠胸部照射后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例

3 討論

RIPF的發(fā)生機(jī)制目前尚未明確，研究表明Treg細(xì)胞在RIPF中發(fā)揮著重要的作用[16]。本研究將C57BL/6小鼠胸部單次照射15 Gy成功構(gòu)建了RIPF模型，并分析了Treg細(xì)胞在纖維化進(jìn)程的動態(tài)變化，結(jié)果表明小鼠在照射后2天外周血、肺組織和脾臟中的Treg比例均明顯上升，17天仍明顯升高，照射后3個(gè)月逐漸下降；照射后5個(gè)月外周血和肺組織中的比例下降至對照組水平，脾臟則下降至明顯低于對照組水平。

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞是來源于胸腺的CD4+T細(xì)胞亞群，持續(xù)性表達(dá)CD25和Foxp3，它可通過下調(diào)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答來維持免疫耐受[17]。Treg細(xì)胞在肺纖維化中的作用是近些年來的研究熱點(diǎn)，越來越多的研究表明Treg細(xì)胞在肺纖維化中發(fā)揮著重要作用[8, 18-20]。雖然導(dǎo)致肺纖維化的原因眾多，如病毒或細(xì)菌感染、藥物、輻射、吸煙、粉塵等，但它們存在著相同的病理過程，即病因?qū)е碌募?xì)胞損傷啟動了機(jī)體與免疫相關(guān)的損傷修復(fù)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞異常激活、不斷增殖。關(guān)于Treg細(xì)胞在不同因素導(dǎo)致肺纖維化中的數(shù)量變化的研究結(jié)果不盡相同：在特發(fā)性肺纖維化患者中，外周血和肺泡灌洗液的Treg細(xì)胞數(shù)均低于正常人群[8]；矽肺患者中，Treg細(xì)胞數(shù)量卻增多[21]；在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，Treg細(xì)胞減少[22]；而在小鼠RIPF模型中，外周血中Treg/CD4+T細(xì)胞比例在第14天時(shí)短暫升高后恢復(fù)正常水平，而肺組織中Treg細(xì)胞從第14天到6個(gè)月內(nèi)持續(xù)升高[16]。本研究結(jié)果表明，在早期放射性肺炎階段，外周血、肺組織和脾臟中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例均明顯上升；在纖維化前期或纖維化階段，外周血和肺組織中其比例逐漸下降并恢復(fù)至正常水平，而脾臟中則逐漸下降至低于正常水平。其中Treg細(xì)胞在照射后早期升高的現(xiàn)象與Xiong等[16]的研究結(jié)果相同，但肺組織在纖維化階段則表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。這可能與RIPF模型構(gòu)建的照射設(shè)備和劑量不同有關(guān)，本研究采用的是目前臨床中普及的直線加速器的6 MV X線及多葉光柵給予肺部照射和危及器官的保護(hù)，這與當(dāng)前治療條件下患者肺部照射后導(dǎo)致RIPF的情況更接近。

目前對于Treg細(xì)胞在RIPF中的作用是抑制或促進(jìn)尚未達(dá)成共識。一方面，Treg細(xì)胞可能通過抑制成纖維細(xì)胞的增殖直接抑制纖維化，通過抗炎和降低輔助性T細(xì)胞的反應(yīng)間接抑制纖維化。另一方面，它也可能通過分泌促纖維化細(xì)胞因子如血小板源性生長因子 B 和轉(zhuǎn)化生長因子-β促進(jìn)纖維化。較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，在早期放射性肺炎階段損傷是可逆的，一旦導(dǎo)致肺纖維化的微環(huán)境已形成，肺纖維化的進(jìn)程則難以糾正[23]。有研究表明，通過抗 CD25 單抗在肺纖維化早期去除Treg 細(xì)胞可減輕纖維化，而肺纖維化晚期去除Treg 細(xì)胞則加重纖維化，因此認(rèn)為Treg 細(xì)胞在小鼠肺纖維化的早期起促進(jìn)纖維化作用，但在肺纖維化的晚期起抑制纖維化作用[24]。這可解釋本研究中Treg細(xì)胞數(shù)在早期放射性肺炎階段明顯升高而后期纖維化階段下降這一現(xiàn)象。同時(shí)也提示，在肺炎階段對Treg細(xì)胞的干預(yù)可能是治療RIPF的一種可選思路。

綜上所述，小鼠外周血、肺組織和脾臟中Treg細(xì)胞比例在早期放射性肺炎階段明顯升高而后期纖維化階段下降。Treg細(xì)胞在RIPF過程中的具體調(diào)節(jié)作用尚未明確，需進(jìn)一步研究，以期為闡明RIPF的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施提供參考。