周洋，陳兵海，王誠悅

(江蘇大學附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

腎癌又稱腎細胞癌，在人類泌尿系腫瘤中占第二位，外科手術(shù)根治是最主要的治療手段，然而腎癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制仍然未得到闡明[1]。越來越多的長鏈非編碼RNA(LncRNA)被證實參與了細胞內(nèi)多種重要的調(diào)控過程。LncRNA在腎癌細胞中的生物基礎(chǔ)研究進展能夠提高腎癌的預測、診斷和個體化治療能力[2]。

基因編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，目前已經(jīng)由第1代“鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)”和第2代“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”發(fā)展到第3代“基因組定點編輯技術(shù)”[3]。與前兩代基因編輯技術(shù)相比，第3代基因編輯技術(shù)具有操作簡便，快捷高效，耗費成本低等優(yōu)點[4-5]。正是有了這些優(yōu)勢，第3代基因編輯技術(shù)迅速成為科研和醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。CRISPR/Cpf1是第3代“基因組定點編輯技術(shù)”的最新代表。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過分析和對比微陣列數(shù)據(jù)集可以找到腫瘤中差異表達的基因[6]。本研究通過分析和對比微陣列數(shù)據(jù)集GSE61763中的樣本實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)LncRNA458314在腎透明細胞癌組織樣本中的表達與在非病理性腎組織樣本中的表達相比有明顯差異，信噪比為0.88。因此，本研究通過新基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1來編輯腎癌細胞中的LncRNA458314，以探討LncRNA458314在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

腎癌細胞株769P來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫細胞公司，在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。293T細胞株購自漢恒生物科技(上海)有限公司，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。RNA提取試劑盒購買自上海超研生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購買自南京諾維贊生物科技有限公司。蛋白質(zhì)印跡實驗使用的一抗pAKT、pERK、LC3A/B、GAPDH及二抗均購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒 共分為5個步驟：① 設(shè)計兩個gRNA序列,gRNA1的序列為 5′-ACACTGGAAGCCCCTGAGAGAGA-3′，gRNA2的序列為5′-CAGATTCGTGTCTATGTTCTTCT-3′; ② BSMBI內(nèi)切酶切開PY108質(zhì)粒并提純; ③ 將克隆的gRNA序列克隆連接于PY108質(zhì)粒中; ④ 轉(zhuǎn)化; ⑤ 目的質(zhì)粒測序驗證。

1.2.2 制作慢病毒 REV、GAG和VSVG質(zhì)粒的制備：3支搖菌管中分別加入5 μL上述3種菌液和5 mL氨芐西林抗性培養(yǎng)基，然后置于37℃搖床12 h。按小抽試劑盒說明書抽提3種質(zhì)粒后，放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

病毒液制備：三無(無血清、無雙抗、無谷氨酰胺)DMEM培養(yǎng)基饑餓293T細胞2 h后換成普通DMEM培養(yǎng)基，然后配置A和B液(A液為200 μL三無培養(yǎng)基加1.5 μg目的質(zhì)粒和包裝系統(tǒng)混合液3 μg；B液為200 μL三無培養(yǎng)基加4 μL lip2000并于室溫放置5 min)。將上述A、B液混勻后，室溫放置20 min后加入293T細胞中。第3天將原培養(yǎng)基換為含有2%血清的DMEM培養(yǎng)基。第5天收集病毒液(3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，取上清液)，置于-80℃保存。

1.2.3 病毒感染769 P細胞 第1天種適當密度的769P細胞至6孔板；第2天加入病毒液；第3天補加1 mL培養(yǎng)基，保留原病毒液；第4天消化細胞，取5、10、20、50和100 μL細胞懸液分別加入大板中進行培養(yǎng)；第5天加入濃度為1 μg/ μL的嘌呤霉素10 μL進行篩選，大約1～2周后有單克隆出現(xiàn)。挑選17個單克隆分別置于6孔板培養(yǎng)，等待滿板后用于熒光定量PCR檢測。

1.2.4 實時定量PCR檢測LncRNA458314的表達 將培養(yǎng)的所有單克隆細胞用RNA提取試劑盒提取出RNA后，使用分光光度儀檢測RNA的濃度及純度，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。最后按照RT-PCR試劑盒說明書檢測對照組769P細胞和實驗組單克隆細胞中LncRNA458314 的相對表達量，反應條件：預變性95 ℃ 5 min；40個循環(huán)反應95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.2.5 CCK8實驗檢測LncRNA458314敲除后769P細胞的增殖能力 準備對照組和實驗組細胞，通過細胞計數(shù)將96孔板的每個單孔細胞固定為1萬個，并設(shè)置0、24、48和72 h四個時間點。按照CCK-8試劑盒說明書的實驗步驟進行操作，分別測得對照組及單克隆組各時間點的光密度(D)值用于分析和作圖。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測LncRNA458314敲除后769P細胞pAKT、pERK、LC3A/B蛋白的表達 收集細胞后，加入裂解液裂解細胞30 min，提取蛋白后根據(jù)標準曲線檢測蛋白濃度，蛋白變性后上樣予SDS-PAGE凝膠電泳，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，以3%BSA封閉1 h，以兔抗人一抗pAKT、pERK、LC3A/B和GAPDH(1 ∶1 000)4℃ 孵育過夜，羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒結(jié)果

使用酶切、連接克隆靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒后進行電泳。靶向LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒大小為12.8 kb，見圖1。提取目的質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果顯示LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

圖1 LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒電泳圖

圖2 LncRNA458314 CRISPR/Cpf1質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2 敲除單克隆中LnRNA458314的表達

實時定量PCR結(jié)果顯示，17個單克隆細胞中的LncRNA458314表達量較對照組細胞均有下調(diào)，見圖3。

C：對照組；1-17：1號-17號敲除單克隆

通過多次實時定量PCR檢測對比后，挑選了6號(6#)、13號(13#)單克隆進行后續(xù)實驗。同時再次對6#、13#單克隆進行實時定量PCR檢測，證實6#、13#單克隆中的LncRNA458314表達量較對照組顯著下降(6#：t=-32.237，P<0.01；13#：t=-26.653，P<0.01)。見圖4。

*：P<0.01，與對照組比較

2.3 LncRNA458314敲除單克隆的增殖能力

CCK8實驗結(jié)果顯示，LncRNA458314下調(diào)后，單克隆6#和13#在72 h時間點的增殖能力較對照組明顯下降(6#：t=-3.798，P<0.05；13#：t=-6.411，P<0.01)。見圖5。

*：P<0.05，#:P<0.01,與對照組比較

2.4 LncRNA458314敲除單克隆pAKT、pERK和LC3A/B的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，6#和13#單克隆pAKT的表達水平顯著下降(6#：t=-63.827，P<0.01；13#：t=-113.332，P<0.01)；pERK的表達水平明顯下降(6#：t=-28.545，P<0.01；13#：t=-111.135，P<0.01)；LC3A/B的表達顯著上升(6#：t=24.417，P<0.01；13#：t=43.140，P<0.01)。見圖6。

3 討論

腎癌是一種多基因相關(guān)的腫瘤,通過研究腎癌相關(guān)LncRNA可以加深人們對于腎癌發(fā)病機制的理解，同時也有利于腎癌的診斷和治療[7]。新基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1中的Cpf1是Cas9的替代者，與Cas9相比，Cpf1有其獨特的優(yōu)勢[8]。第一，Cpf1的分子量比 Cas9 小且只需要一個RNA分子輔助即可[9-10]；第二，Cpf1識別的PAM序列具有特征性，能更好地進行基因編輯[11]；第三，Cpf1切割DNA形成黏性末端，相比于Cas9 切割 DNA 形成的平末端，能更好地使目的基因插入[12]。目前CRISPR 基因編輯技術(shù)的缺點是可能存在脫靶效應[13]。脫靶效應的產(chǎn)生原因就是CRISPR/Cpf1在基因編輯中達到編輯目的后不能及時終止，從而導致在不必要的位點隨意剪切[14]。對CRISPR/Cpf1 基因編輯來說，精確調(diào)控 Cpf1在什么時間、什么位置進行基因編輯是十分重要的[15]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)抗 CRISPR 蛋白可以有效地降低脫靶效應，其中的一種名叫“AcrllA4”的蛋白能將脫靶效應發(fā)生率減少 4 倍左右[16]。我們通過新基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1成功敲除了腎癌細胞中的LncRNA458314，并通過初步研究發(fā)現(xiàn)腎癌的發(fā)生與發(fā)展可能與LncRNA458314相關(guān)，對該LncRNA的進一步分析有利于揭示腎癌的發(fā)病機制，從而可能為腎癌的早期篩查提供新的分子標志物。

*：P<0.01，與對照組比較

本研究結(jié)果表明LncRNA458314敲除后單克隆6#和13#的增殖能力明顯下降。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，下調(diào)腎癌769P細胞中LncRNA458314的表達后，pAKT和pERK的表達水平下降，LC3A/B的表達上升。AKT在調(diào)控細胞增殖和凋亡的過程中起到至關(guān)重要的作用。研究表明AKT通過磷酸化和滅活多個靶標來抑制凋亡從而促進了細胞的增殖[17]。LncRNA458314敲除后單克隆6#和13#的pAKT表達下降，我們推測LncRNA458314通過激活pAKT來促進腎癌細胞的增殖。pERK信號通路與癌癥診斷和治療密切相關(guān)并且可以響應多種細胞內(nèi)刺激，例如促分裂原、激活生長因子和細胞因子等[18]。pERK的表達在LncRNA458314敲除后單克隆6#和13#中降低，推測LncRNA458314可能激活了pERK的表達，從而促進了腎癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明LC3A/B表達的高低與細胞自噬的能力有著一定的關(guān)系[19]。LC3A/B表達量在LncRNA458314敲除后單克隆6#和13#中表達明顯增加，我們推測LncRNA458314通過抑制LC3A/B的表達進而抑制了細胞自噬。

綜上所述，本研究應用新基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1成功敲除了腎癌細胞769P中的LncRNA458314。實驗初步證實LncRNA458314可能是促進腎癌細胞增殖的重要基因，LncRNA458314可能通過調(diào)控pAKT、pERK和LC3A/B發(fā)揮其生物學作用。