王云帆，戴東方，傅聰，陳德玉

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)是一種DNA傳感器，在DNA識(shí)別領(lǐng)域有重要意義[1]。cGAS能夠識(shí)別異常存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA，催化生成環(huán)鳥腺苷酸(cyclic GMP-AMP, cGAMP)，隨后結(jié)合并激活STING蛋白，通過干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和TANK結(jié)合激酶1(TBK1)促進(jìn)Ⅰ型干擾素(IFN)表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用[2]。越來越多的證據(jù)表明cGAS在抗病毒免疫、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用[3-5]。但對(duì)于實(shí)體腫瘤中cGAS如何影響腫瘤生物學(xué)行為及分子機(jī)制卻少有研究。

食管癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病人數(shù)超過了全世界的50%[6]。我國(guó)90%以上的食管癌病理類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[7]。雖然手術(shù)、放療、化療等三大主要治療方法都在進(jìn)步，但食管癌的5年生存率仍不高[8]。cGAS既是DNA受體，也是一種酶類，它可以與藥物小分子特異性結(jié)合，也許能成為抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。本研究利用免疫組化分析了60例食管鱗癌患者的癌組織與癌旁組織中cGAS的表達(dá)情況；使用慢病毒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株TE-1，構(gòu)建穩(wěn)定敲減cGAS基因的TE-1細(xì)胞系，探索敲減cGAS對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2018年7月至12月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除且經(jīng)病理證實(shí)的60例食管鱗癌標(biāo)本，患者均簽署知情同意書。所有入選患者術(shù)前均未行抗癌治療。取癌組織與癌旁組織進(jìn)行甲醛固定及石蠟包埋切片。

1.1.2 質(zhì)粒與細(xì)胞 包裝慢病毒的質(zhì)粒pLKO.1 TRC 克隆載體、pMD2.G和psPAX2，HEK-293T、Het-1A、TE-1、KYSE-150細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK-293T細(xì)胞用含有10%胎牛血清(Gibco公司)的 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)；Het-1A、TE-1、KYSE-150細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑與儀器 cGAS、β-肌動(dòng)蛋白、HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體購(gòu)自CST公司；CCK8試劑購(gòu)自日本同仁公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福麥斯生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色觀察食管鱗癌組織中cGAS表達(dá) 將石蠟包埋的食管鱗癌組織切片常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，3%過氧化氫孵育培養(yǎng)，加入1 ∶250稀釋的cGAS一抗4 ℃孵育過夜。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗孵育。HRP山羊抗兔二抗室溫孵育后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后封片。兩名病理醫(yī)師在顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野(×200倍)觀察，cGAS表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分如下，① 陽性染色細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞的比例<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；② 染色強(qiáng)度：無顯色為0分，淺棕色為1分，棕色為 2 分，深棕色為 3 分。若兩項(xiàng)評(píng)分的乘積≥6分則定義為cGAS高表達(dá)，若兩項(xiàng)評(píng)分的乘積<6分則定義為低表達(dá)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cGAS mRNA表達(dá)水平 提取Het-1A、TE-1、KYSE-150細(xì)胞以及cGAS敲減和空載對(duì)照TE-1細(xì)胞總RNA，測(cè)RNA樣品濃度和純度，使得D(260 nm/280 nm)在1.8 ～ 2.0間。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列如下：cGAS上游引物5′-CACGAAGCCAAGACCTCCG-3′，下游引物5′-GTCGCACTTCAGTCTGAGCA-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，下游引物5′-CGTACAGGTCTTTGCGGATG-3′。反應(yīng)條件：95℃ 2 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s 變性，60 ℃ 20 s 退火/延伸，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算cGAS的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞cGAS蛋白的表達(dá) 分別取Het-1A、TE-1、KYSE-150細(xì)胞，以及cGAS敲減和空載對(duì)照TE-1細(xì)胞各2×106個(gè)，用RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒蛋白定量。SDS-PAGE電泳后，恒流轉(zhuǎn)膜2 h，脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃ cGAS抗體(1 ∶1000)孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。蛋白顯像并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 慢病毒包裝及感染TE-1細(xì)胞 設(shè)計(jì)cGAS基因的敲減靶序列1：CTTTGATAACTGCGTGACATA，靶序列2：GATGCTGTCAAAGTTTAGGAA，將對(duì)照組空載質(zhì)粒pLKO.1 TRC克隆載體、cGAS敲減的質(zhì)粒與pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染至HEK-293T，36 h后收集上清病毒液。取1×106個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1細(xì)胞種于6孔板中，貼壁后血清培養(yǎng)基1.75 mL、病毒液750 μL和聚凝胺20 μg混合感染TE-1細(xì)胞，10 h后換正常培養(yǎng)基。感染48 h后，以流式分選將GFP陽性細(xì)胞收集后培養(yǎng)。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率。分別命名穩(wěn)定敲減TE-1細(xì)胞為sh1-cGAS、sh2-cGAS。

1.2.5 CCK8檢測(cè)敲減cGAS后TE-1細(xì)胞的增殖 取穩(wěn)定敲減和對(duì)照細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于24、48和72 h檢測(cè)。檢測(cè)前每孔加10 μL CCK8，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中4 h后酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定光密度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減cGAS后TE-1細(xì)胞的增殖 取穩(wěn)定敲減和對(duì)照細(xì)胞按每孔300個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)14 d，定期換液后，棄培養(yǎng)基，用甲醇固定15 min，隨后結(jié)晶紫染色15 min，用PBS輕輕漂洗3次。拍照后用Image J軟件計(jì)克隆數(shù)分析。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減cGAS后TE-1細(xì)胞的遷移 將穩(wěn)定敲減和對(duì)照細(xì)胞接種至24孔板，取5×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪入，人工劃筆直的劃痕約2 mm，劃痕后0 h、24 h拍照，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減cGAS后TE-1細(xì)胞的遷移 無血清培養(yǎng)基重懸穩(wěn)定敲減和對(duì)照細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL。500 μL 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基加入小室下部，小室上部加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦去殘留在上室內(nèi)的細(xì)胞，甲醇固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲減cGAS后TE-1細(xì)胞的凋亡 將穩(wěn)定敲減和對(duì)照細(xì)胞種入6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。過夜貼壁24 h使用Annexin V/PI雙染后進(jìn)行流式檢測(cè)，使用Flowjo分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 cGAS在食管鱗癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，cGAS主要在食管鱗癌的細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)為棕黃色顆粒。在食管鱗癌組織中，有39例(65%)cGAS呈現(xiàn)高表達(dá)；21例(35%)cGAS呈現(xiàn)低表達(dá)。在癌旁組織中，cGAS均呈現(xiàn)為低表達(dá)甚至陰性。見圖1。

圖1 cGAS在食管鱗癌組織中的表達(dá)(免疫組化×200倍)

2.2 cGAS在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞系TE-1、KYSE-150中cGAS mRNA的表達(dá)明顯高于食管正常上皮細(xì)胞Het-1A(t值分別為10.35、6.86，P<0.01，圖2A)；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示TE-1、KYSE-150細(xì)胞cGAS蛋白表達(dá)高于Het-1A(圖2B)。

A:熒光定量PCR；B:蛋白質(zhì)印跡；*：P<0.01，與Het-1A細(xì)胞比較

圖2 cGAS在食管正常上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 重組慢病毒質(zhì)粒細(xì)胞感染及cGAS敲減的鑒定

選取cGAS表達(dá)量高的細(xì)胞系TE-1，將對(duì)照空載體病毒和敲減cGAS病毒分別感染TE-1細(xì)胞后72 h，流式分選收集GFP陽性細(xì)胞培養(yǎng)，傳代3次，在熒光顯微鏡觀察，可見各組細(xì)胞GFP陽性率均在90%以上。熒光定量PCR結(jié)果顯示，sh1-cGAS、sh2-cGAS細(xì)胞cGAS mRNA均明顯降低(t分別為6.46、5.96，P<0.01)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果亦表明敲減后TE-1細(xì)胞cGAS蛋白表達(dá)降低。結(jié)果表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定的sh1-cGAS、sh2-cGAS細(xì)胞系。見圖3。

A:熒光轉(zhuǎn)染效率(×200倍)；B:熒光定量PCR；C:蛋白質(zhì)印跡；*：P<0.01，與空載體對(duì)照組比較

圖3 驗(yàn)證TE-1細(xì)胞中cGAS敲減效果

2.4 敲減cGAS對(duì)TE-1細(xì)胞增殖能力的影響

取食管鱗癌細(xì)胞TE-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系sh1-cGAS、sh2-cGAS，CCK8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，敲減組細(xì)胞增殖較對(duì)照組顯著抑制(P<0.01，圖4)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明，sh1-cGAS、sh2-cGAS組克隆形成數(shù)目較對(duì)照組明顯降低(t分別為27.02、21.19，P<0.01)，見圖5。

*：P <0.01，與空載體對(duì)照組比較

*：P<0.01，與空載體對(duì)照組比較

2.5 敲減cGAS對(duì)TE-1細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh1-cGAS、sh2-cGAS組傷痕愈合率明顯降低(t分別為10.55、5.74，P<0.01)，穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少(t分別為11.46、8.59，P<0.01)。見圖6和圖7。

*：P<0.01，與空載體對(duì)照組比較

*：P<0.01，與空載體對(duì)照組比較

2.6 敲減cGAS對(duì)TE-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，sh1-cGAS、sh2-cGAS組TE-1細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞所占百分比較對(duì)照組明顯增加(t分別為16.16、11.68，P<0.01)，見圖8。

*：P<0.01，與空載體對(duì)照組比較

3 討論

基因組不穩(wěn)定性是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，通過同源重組準(zhǔn)確修復(fù)DNA雙鏈斷裂可以保留基因組完整性并抑制腫瘤發(fā)生，cGAS是一種胞質(zhì)DNA傳感器，可通過啟動(dòng)STING-IRF3-Ⅰ型IFN信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)來激活先天免疫[1,9]。以往的研究大多集中于探索cGAS在固有免疫細(xì)胞中的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。cGAS在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可結(jié)合因損傷而積累的雙鏈DNA，進(jìn)而激活下游的cGAS-STING信號(hào)通路，并最終促進(jìn)包括促炎因子在內(nèi)的多種基因表達(dá)，將MHC-Ⅰ分子結(jié)合肽呈遞在腫瘤細(xì)胞表面，使腫瘤細(xì)胞可被CD8+T細(xì)胞識(shí)別[10]，進(jìn)而促進(jìn)了抗腫瘤免疫的功效。也有研究表明腫瘤放射線處理后可以通過cGAS-STING途徑誘導(dǎo)細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而改變腫瘤微環(huán)境并抑制腫瘤殺傷性T細(xì)胞的功能[11]。本研究結(jié)果顯示，cGAS在食管鱗癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯升高，且進(jìn)一步在永生化的食管鱗癌細(xì)胞系和食管正常上皮細(xì)胞中對(duì)應(yīng)地證明了這一點(diǎn)，提示其在食管鱗癌中可能發(fā)揮了調(diào)節(jié)功能。

最近的研究表明，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷的情況下，cGAS會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核中，并被招募至DNA雙鏈斷裂部位，并直接與組蛋白變體γH2AX發(fā)生直接相互作用，進(jìn)而參與斷裂DNA的同源重組與損傷修復(fù)。對(duì)應(yīng)的，過度表達(dá)的cGAS增加了體外腫瘤細(xì)胞的惡性潛能，而肺癌細(xì)胞中敲除cGAS后減少了小鼠中形成的腫瘤體積[4,12]。本研究中cGAS敲減后顯著抑制了食管鱗癌細(xì)胞的增殖與遷移能力，且敲減的細(xì)胞凋亡明顯增加。我們推測(cè)cGAS可能作為一種新的癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此cGAS可作為癌癥治療新的潛在分子靶點(diǎn)[13-14]。但是cGAS在食管鱗癌細(xì)胞中是否也參與了DNA的損傷修復(fù)還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定。后續(xù)我們將進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本，深入地研究cGAS在食管鱗癌中的調(diào)節(jié)功能與相關(guān)的分子機(jī)制，并評(píng)估cGAS與臨床食管鱗癌治療效果和預(yù)后的關(guān)系。