許學(xué)文，宋廉，楊曉曉，石卉，龔愛華，王鳴，張禮榮

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤，中位生存期為12～15個月，5年生存期低于5%[1]。盡管GBM的放療、化療及其他輔助治療對改善患者的生存期具有一定的效果，但其復(fù)發(fā)率仍然較高[2]。當(dāng)前基于基因表達圖譜將GBM分為4個亞型：前神經(jīng)型(33%)、神經(jīng)型(12%)、經(jīng)典型(20%)及間質(zhì)型(32%)[3]；其中間質(zhì)型具有惡性程度高、預(yù)后差的特點，且前神經(jīng)型具有間質(zhì)型轉(zhuǎn)化的特征，即前神經(jīng)型-間質(zhì)型轉(zhuǎn)化(proneural-mesenchymal transition, PMT)[4]，然而其確切的分子機制仍不是十分清楚。

趨化因子及其受體在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的機制已成為目前研究的熱點[5]。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)屬于趨化因子受體CXCR亞家族，CXC趨化因子配體-12(CXC chemokine ligand 12，CXCL12)是其唯一配體，CXCL12-CXCR4軸在促進干細胞歸巢、誘導(dǎo)血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方面具有重要的作用[6]。但是，CXCL12-CXCR4軸在膠質(zhì)瘤中的作用尚不完全清楚，本研究擬探討CXCL12-CXCR4軸在膠質(zhì)母細胞瘤PMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人膠質(zhì)瘤LN428，U87MG細胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；CXCL12(美國Genscript公司)；普樂沙福(美國 MedChem Express公司)；高糖DMEM、PBS(美國Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美國Gibco公司)；兔單克隆抗體N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1(chtinase-3-like-1 protein，CHI3L1/YKL-40)、波形蛋白、β-微管蛋白(美國Cell Signaling Technology公司)；鼠單克隆抗體少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2，OLIG2)，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；基質(zhì)膠、Transwell小室(美國Corning Incorporated公司)；ECL發(fā)光液(美國Millipore公司)；牛血清白蛋白(德國 BioFroxx公司)；CCK8試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤LN428、U87MG細胞株均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細胞生長至80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 免疫印跡實驗檢測細胞前神經(jīng)型和間質(zhì)型相關(guān)蛋白

1.3.1 選擇CXCL12在細胞中最佳作用濃度 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化重懸，接種入6孔板，每孔培養(yǎng)基補足至2 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中觀察；次日細胞貼壁后，觀察細胞狀態(tài)良好，細胞接種密度為60%～70%；將細胞分為CXCL12不同濃度(0、20、40、60、80、100 ng/mL)處理組，共培養(yǎng)48 h后收集各組細胞；預(yù)冷PBS清洗，立即加入蛋白裂解液提取總蛋白，100℃煮沸10 min；4 ℃行12 000×g離心10 min，上清液即為蛋白樣品。以每個泳道20 μg蛋白樣品上樣，行10%變性SDS-PAGE；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min；加入一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入二抗室溫搖床孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；ECL 發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光并使用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析，與內(nèi)參β-微管蛋白比較。一抗N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、YKL-40、β-微管蛋白稀釋比均為1 ∶1 000、一抗OLIG2的稀釋比為1 ∶500；二抗稀釋比均為1 ∶10 000。每組實驗獨立重復(fù)3次。根據(jù)蛋白表達量選擇CXCL12最佳作用濃度。

1.3.2 檢測普樂沙福對細胞前神經(jīng)型和間質(zhì)型相關(guān)蛋白的影響 將細胞分為對照組，CXCL12組，普樂沙福組，CXCL12+普樂沙福組，分別予以PBS，80 ng/mL CXCL12，20 μmol/L普樂沙福，80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普樂沙福處理。采用免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達。具體實驗操作方法同“1.3.1”。每組實驗獨立重復(fù)3次。

1.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化重懸，接種入6孔板，每孔培養(yǎng)基補足至2 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；次日細胞貼壁后，觀察細胞狀態(tài)良好，細胞接種密度為60%～70%。將細胞分為對照組，CXCL12組，CXCL12+普樂沙福組，分別予以PBS, 80 ng/mL CXCL12，80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普樂沙福處理。共培養(yǎng)48 h后收集各組細胞。在侵襲實驗前，小室上層鋪100 μL 1 ∶20稀釋的基質(zhì)膠，置于細胞培養(yǎng)箱，待膠凝固后備用。遷移實驗無須鋪膠。將3×104個膠質(zhì)瘤細胞用100 μL無血清高糖DMEM重懸置于小室上層，小室下層加入500 μL含10%胎牛血清的高糖DMEM。將小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h；4%低聚甲醛固定30 min；用棉簽輕輕拭去小室內(nèi)面細胞；用0.1%結(jié)晶紫染色液浸染30 min，風(fēng)干后置于顯微鏡下觀察并拍照；運用Image J軟件計算穿膜細胞數(shù)。每組實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖率

制得單細胞懸液，以1 000個/孔密度接種于96孔板；次日細胞貼壁后，實驗分組同“1.4”，同時設(shè)空白組(只含DMEM)進行校正，每組設(shè)3個復(fù)孔。按說明書要求，每天加入10 μL CCK8試劑，放置培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的光密度值。以培養(yǎng)時間為橫軸，相對增殖率為縱軸，繪制細胞生長曲線。每組實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期細胞，制備單細胞懸浮液，并以1 000個/孔密度接種于6孔板，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，實驗分組同“1.4”。每隔3至4天半換液1次，靜置培養(yǎng)2～3周；當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)；4%低聚甲醛固定30 min；0.1%結(jié)晶紫染色30 min；拍照并計算克隆數(shù)。每組實驗獨立重復(fù)3次。

1.7 生物信息學(xué)分析

通過Cancer Brower下載TCGA中膠質(zhì)瘤患者的mRNA表達及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，分析CXCR4 mRNA在健康者與患者以及在GBM患者不同亞型中的表達水平，進一步分析CXCR4 mRNA與CXCL12、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、YKL-40、OLIG2 mRNA的相關(guān)性。以平均值為界，將高于和低于平均值分別定義為高表達組和低表達組。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CXCR4在膠質(zhì)瘤中的表達及病理分析

TCGA-GBM(AffyU133a)數(shù)據(jù)庫樣本共539例，其中健康者腦組織樣本10例，腦膠質(zhì)瘤組織樣本529例(前神經(jīng)型139例，間質(zhì)型158例，經(jīng)典型145例，神經(jīng)型87例)。與健康者腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中CXCR4 mRNA表達水平顯著增高(t=7.346，P<0.01)；CXCR4高表達組(n=262)膠質(zhì)瘤患者總體生存率明顯低于低表達組(n=262，χ2=5.056，P<0.05)；CXCR4 mRNA在前神經(jīng)型中表達明顯低于間質(zhì)型(t=10.53，P<0.01)?；虮磉_熱圖分析表明，CXCR4 mRNA與CXCL12、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、YKL-40 mRNA成正相關(guān)，與E-鈣黏蛋白、OLIG2 mRNA成負相關(guān)。見圖1。

2.2 選擇CXCL12在膠質(zhì)瘤細胞中最佳作用濃度

免疫印跡實驗結(jié)果顯示，不同濃度CXCL12(0、20、40、60、80、100 ng/mL)預(yù)處理后，與0 ng/mL相比，80 ng/mL CXCL12處理后細胞內(nèi)OLIG2(LN428：t=14.62，U87MG：t=8.46，P均<0.05)、E-鈣黏蛋白(LN428：t=18.03，U87MG：t=6.27，P均<0.05)的表達顯著降低，YKL-40(LN428：t=11.02，U87MG：t=11.57，P均<0.01)、N-鈣黏蛋白(LN428：t=5.83，U87MG：t=12.79，P均<0.05)、波形蛋白(LN428：t=5.30，U87MG：t=10.58，P均<0.05)的表達顯著增高。綜合考慮，選擇80 ng/mL CXCL12作為最佳實驗濃度進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖1 TCGA膠質(zhì)瘤(AffyU133a)數(shù)據(jù)庫分析CXCR4 mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

2.3 CXCL12-CXCR4軸促進膠質(zhì)瘤細胞PMT

免疫印跡實驗結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)80 ng/mL CXCL12處理后，OLIG2蛋白表達水平較對照組顯著降低(LN428：t=5.66，U87MG：t=12.53，P均<0.05)，YKL-40蛋白表達水平較對照組顯著上升(LN428：t=8.66，U87MG：t=15.30，P均<0.01)；而經(jīng)20 μmol/L普樂沙福和80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普樂沙福分別處理后，與CXCL12組對比，OLIG2蛋白表達水平顯著升高(LN428：t=13.98，9.82，U87MG：t=16.42，10.73，P均<0.01)，YKL-40蛋白表達水平顯著降低(LN428：t=22.52，24.45，U87MG：t=16.38，18.40，P均<0.01)。見圖3。

2.4 CXCL12-CXCR4軸促進膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移

Transwell結(jié)果顯示，80 ng/mL CXCL12預(yù)處理48 h后，膠質(zhì)瘤細胞遷移(LN428：t=11.46，U87MG：t=16.52，P均<0.01)和侵襲(LN428：t=6.03，U87MG：t=10.05，P均<0.01)數(shù)量顯著多于對照組；給予普樂沙福處理后，與單純 CXCL12組比較，細胞遷移(LN428：t=9.22，U87MG：t=11.42，P均<0.01)和侵襲(LN428：t=5.37，U87MG：t=8.53，P均<0.01)數(shù)量則顯著降低。見圖4。

a：P<0.05，b：P<0.01

a：P<0.01

2.5 CXCL12-CXCR4軸促進膠質(zhì)瘤細胞增殖

克隆形成實驗顯示，與對照組相比，膠質(zhì)瘤LN428細胞CXCL12組形成的克隆數(shù)顯著增多(t=28.46，P<0.01)，加入普樂沙福后，細胞克隆數(shù)顯著減少(t=35.10，P<0.01)。由于膠質(zhì)瘤U87MG細胞株彌漫性生長方式導(dǎo)致細胞的克隆不明顯，與對照組相比，CXCL12組細胞克隆數(shù)顯著增多(t=10.50，P<0.01)，加普樂沙福后，細胞克隆數(shù)顯著降低(t=16.50，P<0.01)。此外，CCK8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞CXCL12組細胞增殖率顯著增高(LN428：t=8.28，U87MG：t=3.98，P均<0.01)，加入普樂沙福后，細胞增殖率顯著降低(LN428：t=8.252，U87MG：t=9.60，P均<0.01)。見圖5。

a：P<0.05，b：P<0.01,與對照組比較；c：P<0.05，與CXCL12+普樂沙福組比較

3 討論

膠質(zhì)瘤腫瘤細胞前神經(jīng)型和間質(zhì)型可以互相轉(zhuǎn)換，并受周圍微環(huán)境的精確調(diào)控[7]。CXCR4是一種高度保守的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，首次在外周血白細胞中發(fā)現(xiàn)，在多種細胞類型中呈高表達，包括淋巴細胞、造血干細胞、基質(zhì)成纖維細胞和癌細胞[8]。本研究結(jié)果顯示，與健康者相比，膠質(zhì)瘤患者CXCR4 mRNA表達增高，且與患者生存率呈負相關(guān)；基因表達熱圖結(jié)果顯示，CXCR4 mRNA和CXCL12 mRNA與間質(zhì)型指標YKL-40、N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA呈正相關(guān)，與前神經(jīng)型指標OLIG2、E-鈣黏蛋白mRNA呈負相關(guān)。由此表明，CXCL12-CXCR4軸可能與腫瘤惡性生物學(xué)行為有關(guān)。但是，CXCL12-CXCR4軸是否參與膠質(zhì)瘤其他生物學(xué)行為，如PMT、增殖、轉(zhuǎn)移等，還需進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，PMT是膠質(zhì)母細胞瘤局部浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[9]；另有研究表明，膠質(zhì)瘤細胞從前神經(jīng)型向間質(zhì)型的轉(zhuǎn)化過程中，YKL-40的升高和OLIG2的降低代表細胞向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化[10]。本研究結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞中加入外源性CXCL12后，YKL-40蛋白表達顯著升高，OLIG2蛋白顯著降低，且細胞的侵襲、遷移能力顯著增高。由此表明，CXCL12-CXCR4軸可以促進膠質(zhì)瘤細胞PMT，從而增強膠質(zhì)瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移。在抑制CXCL12-CXCR4信號傳導(dǎo)的藥物中，選擇性CXCR4拮抗劑普樂沙福是研究最多、臨床應(yīng)用最廣的化合物[11]。本研究結(jié)果顯示，予以普樂沙福處理后，膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞的間質(zhì)型相關(guān)指標YKL-40蛋白表達顯著降低，前神經(jīng)型相關(guān)指標OLIG2蛋白表達顯著升高，且細胞的遷移和侵襲能力顯著受到抑制。由此表明，普樂沙?？梢宰钄郈XCL12-CXCR4軸，從而抑制膠質(zhì)瘤細胞PMT。

研究表明，腫瘤細胞具有無限增殖的能力，最終導(dǎo)致惡性腫瘤形成[12]。為了進一步驗證CXCL12-CXCR4軸與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，本實驗進行了克隆形成實驗和CCK8法檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。結(jié)果顯示，予以膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞外源性CXCL12處理，細胞的克隆形成能力和相對增殖率顯著增高；普樂沙福處理后，膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞的克隆形成能力和相對增殖率顯著降低。由此表明，CXCL12-CXCR4軸可以提高膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力，阻斷CXCL12-CXCR4軸可以降低膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12依賴性刺激腫瘤細胞上的CXCR4，從而激活包括PI3K/AKT/mTOR在內(nèi)的關(guān)鍵下游通路，參與腫瘤的生存、增殖、轉(zhuǎn)移等過程[13]；另有研究表明，在膠質(zhì)瘤中PI3K/AKT/mTOR信號通路異常活化，抑制通路后可以有效地延長膠質(zhì)瘤患者生存時間[14]。結(jié)合之前的研究，無論CXCL12-CXCR4軸在癌癥中的確切機制如何，該軸在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生進展過程中起著重要作用。CXCL12-CXCR4軸在膠質(zhì)瘤細胞PMT過程中可能激活PI3K/AKT/mTOR信號通路。

綜上所述，本研究利用一定濃度的CXCL12及普樂沙福作用于體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤LN428和U87MG細胞株，表明CXCL12-CXCR4軸可以促進膠質(zhì)瘤細胞PMT；普樂沙福通過阻斷CXCL12-CXCR4軸，可有效抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移，具體分子機制還有待進一步研究。