周李寧，劉月琴，蘇兆亮，周峰，許化溪

(1.江蘇大學醫(yī)學院免疫學研究室, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南通市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 南通 226001；3.江蘇大學第四附屬醫(yī)院中心實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

巨噬細胞是一類具有較強可塑性的免疫細胞[1]。在不同的環(huán)境下，巨噬細胞可極化為具有不同表型及功能的細胞，主要包括M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[2]。M1型巨噬細胞可以分泌大量的促炎因子如IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF-α)、活性氧(ROS)和一氧化氮合酶(iNOS)等，具有很強的促炎功能，而M2型巨噬細胞可以分泌多種抑炎因子如IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等，可促進炎癥消退，具有免疫抑制功能[3]。巨噬細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，許多研究表明在癌癥早期，腫瘤發(fā)生部位的巨噬細胞大多是M1型巨噬細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用；當疾病惡化，病變部位的巨噬細胞將轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細胞，發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。目前，調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型極化的具體分子機制尚不明確[4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類不編碼蛋白且轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子[5]。近年來表明，lncRNA可調(diào)控細胞的分化和增殖，但能否調(diào)控巨噬細胞M2型極化尚不清楚[6]。本研究通過干擾巨噬細胞中長鏈基因間非編碼RNA-p21(lincRNA-p21)的表達，分析其對結(jié)腸癌細胞增殖和腫瘤生長的影響，為干預(yù)腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型極化提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

10只6～8周齡C57BL/6品系小鼠，雌性，體重(20±2)g，購于江蘇大學實驗動物中心(合格證編號：NO.201806076)。小鼠CT26結(jié)腸癌細胞株及RAW264.7小鼠單核巨噬細胞購于上海生命科學研究院細胞庫。DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；lincRNA-p21 siRNA、陰性對照(NC)siRNA(蘇州吉瑪股份有限公司)；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；0.4 μm共培養(yǎng)小室(美國Millipore公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 目的基因表達水平的檢測

CT26腫瘤細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)培養(yǎng)，將細胞置于37℃、含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長良好，達到80%～90%匯合度時進行細胞傳代。收集CT26腫瘤細胞的培養(yǎng)上清液，于4℃、500×g離心5 min；再用0.22 μm濾器進行過濾，-20℃保存。將RAW264.7巨噬細胞接種于24孔板內(nèi)，當細胞密度至50%～60%時，分為兩組：對照組和CT26腫瘤上清液刺激組。對照組常規(guī)培養(yǎng)，CT26上清液刺激組則加入800 μL CT26細胞培養(yǎng)上清液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，加入1 mL的Trizol裂解細胞，提取RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以β-肌動蛋白為內(nèi)參，實時熒光定量PCR檢測lincRNA-p21的表達水平。所用引物序列：β-肌動蛋白上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游5′-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3′；IL-4上游5′-CCTCTGTGGGCTGTCTGATTTT-3′，下游5′-GGGCTCACCCAGGACCTT-3′；IL-6上游5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTT-3′，下游5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；IL-10上游5′-CCAA-GCCTTATCGGAAATGA-3′，下游5′-TTTTCACAGGGGAGAAATCG-3′；lincRNA-p21上游5′-CCTGTCCAC-TCGCTTTC-3′，下游5′-GGAACTGGAGACGGAATG-TC-3′。擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s；進行40個擴增循環(huán)；72℃再延伸10 min。待實時熒光定量PCR擴增結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)測得的Ct值計算2-ΔΔCt值分析目的基因的相對表達量。

1.3 RAW264.7的轉(zhuǎn)染

委托公司設(shè)計針對小鼠來源的lincRNA-p21的siRNA(si-lincRNA-p21)及陰性對照siRNA(NC)。轉(zhuǎn)染前1天將狀態(tài)良好的RAW264.7轉(zhuǎn)種到24孔板中37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，使細胞匯合度達到60%～70%。轉(zhuǎn)染前，配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，同時棄去24孔板中舊的培養(yǎng)液，加入400 μL無血清DMEM培養(yǎng)液。將100 μL的混合液加入到24孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，再進行轉(zhuǎn)染后的其他檢測。

1.4 流式細胞術(shù)檢測CT26的凋亡

接種CT26細胞于24孔板中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)12 h，將0.4 μm共培養(yǎng)小室置于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，分為兩組，上室分別加入轉(zhuǎn)染NC siRNA的RAW264.7和轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7，37℃、5% CO2共培養(yǎng)48 h。取出上室，1 mL的PBS清洗下室CT26細胞，收集兩組下室CT26細胞，4℃、2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，取100 μL緩沖液重懸細胞沉淀。每管分別加入5 μL Annexin-V-APC抗體和10 μL PI抗體，輕柔混勻，4℃避光染色15 min，最后加入400 μL緩沖液混勻細胞，于1h內(nèi)上機檢測。根據(jù)流式細胞術(shù)的結(jié)果，(AnnexinV-APC)-/PI+為壞死細胞，(AnnexinV-APC)-/PI-為活細胞，(AnnexinV-FITC)+/PI-為早凋細胞，(AnnexinV+FITC)+/PI+為晚凋細胞，(AnnexinV-FITC)+/PI-和(AnnexinV+FITC)+/PI+的細胞比例即凋亡細胞比例。

1.5 Transwell檢測CT26細胞的遷移能力

在24孔板內(nèi)接種轉(zhuǎn)染NC siRNA的RAW264.7和轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7，37℃、5% CO2共培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)液，更換800 μL含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，取Transwell小室置24孔板內(nèi)，計數(shù)CT26細胞，每個小室接種1.5×105個腫瘤細胞，并用200 μL無血清DMEM混勻，使腫瘤細胞均勻分布于上室，于37℃、含5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出上室，用棉簽擦除小室內(nèi)沒有穿過微孔的細胞，再將小室置于4%多聚甲醛中固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗3次，每次10 min，倒置小室待干，顯微鏡觀察并計數(shù)穿過微孔的細胞數(shù)量。

1.6 劃痕實驗檢測CT26細胞的遷移能力

在24孔細胞培養(yǎng)板下室培養(yǎng)CT26，每孔接種1×105個腫瘤細胞。同時將0.4 μm共培養(yǎng)小室放置于24孔細胞培養(yǎng)板，將1×105個轉(zhuǎn)染后的RAW264.7均勻分布于上室，將細胞置于37℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。共培養(yǎng)結(jié)束后，取出上室，用PBS緩沖液清洗下室腫瘤細胞后，更換下室培養(yǎng)液為無血清的DMEM培養(yǎng)液，并用小號槍頭于24孔板中輕輕劃出一道橫線。將24孔細胞培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度及面積，再將細胞置于37℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS緩沖液清洗下室腫瘤細胞3次，將24孔細胞培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度。

1.7 荷瘤小鼠模型的建立及腫瘤生長相關(guān)指標的檢測

培養(yǎng)CT26腫瘤細胞，當細胞生長良好時，收集細胞并計數(shù)。選取12只C57BL/6小鼠，隨機分為2組(n=6)，用酒精棉球?qū)ζ浔巢科つw進行消毒，用鑷子輕輕夾起其背部一側(cè)皮膚，用1 mL注射器吸取含1×106個CT26腫瘤細胞的PBS緩沖液100 μL，注射入小鼠皮下。1×106個轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7注射于實驗組小鼠的荷瘤部位，每周1次，連續(xù)4周。對照組小鼠荷瘤部位注射1×106個轉(zhuǎn)染NC siRNA的RAW264.7。待可觸及小鼠皮瘤腫塊時，每隔3天用游標卡尺測量小鼠腫瘤塊的長徑及寬徑。根據(jù)公式V= 1/2×a×b2(a為長徑，b為短徑，單位為mm)計算小鼠腫瘤塊的體積。4周后處死小鼠，剝?nèi)∑淦は履[瘤組織，用電子分析天平測量小鼠瘤塊質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件處理并進行統(tǒng)計學分析，兩組樣本間均數(shù)差異分析采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CT26上清液刺激導(dǎo)致RAW264.7巨噬細胞極化

實時熒光定量PCR檢測表明，與常規(guī)培養(yǎng)的RAW264.7(對照組)相比，CT26腫瘤上清液刺激的RAW264.7 IL-6表達明顯下調(diào)(t=8.829，P<0.01)；而IL-4(t=10.030，P<0.01)和IL-10的表達上調(diào)(t=8.405，P<0.01)，見圖1。結(jié)果提示，CT26腫瘤上清液刺激巨噬細胞后可促進巨噬細胞向抑炎的M2型極化。

圖1 實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞IL-6、IL-4及IL-10的表達

2.2 CT26上清液刺激導(dǎo)致RAW264.7的lincRNA-p21表達上調(diào)

實時熒光定量PCR檢測表明，與對照組相比，CT26腫瘤上清液刺激的RAW264.7 lincRNA-p21表達明顯上調(diào)(t=5.736，P<0.01)。而轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21后，則lincRNA-p21的表達下調(diào)(t=7.745，P<0.01)，見圖2。

2.3 抑制巨噬細胞lincRNA-p21的表達對巨噬細胞極化的影響

實時熒光定量PCR檢測表明，與NC組相比，CT26腫瘤上清液刺激的轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7 IL-6表達明顯上調(diào)(t=8.341，P<0.01)；而IL-4(t=5.750，P<0.01)和IL-10的表達下調(diào)(t=6.493，P<0.01)，見圖3。結(jié)果顯示抑制巨噬細胞lincRNA-p21的表達可促進巨噬細胞向促炎的M1型極化。

圖2 實時熒光定量PCR檢測lincRNA-p21的表達

圖3 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后巨噬細胞IL-6、IL-4及IL-10的表達

2.4 抑制巨噬細胞lincRNA-p21的表達對CT26凋亡和遷移的影響

Transwell小室和劃痕實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7與CT26共培養(yǎng)后，其遷移能力減弱(t= 3.384，P<0.05)，見圖4、圖5。流式細胞分析表明，與轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7共培養(yǎng)后，早期凋亡和晚期凋亡的CT26細胞凋亡率總和增加(t= 4.608，P<0.01)，見圖6。

圖4 Transwell檢測CT26的遷移能力(結(jié)晶紫染色×100)

圖5 劃痕實驗檢測CT26的遷移能力

2.5 抑制巨噬細胞lincRNA-p21表達可延緩荷瘤小鼠皮下瘤的生長

與NC組相比，注射轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的RAW264.7的小鼠，第19、22和25天腫瘤體積明顯減小(t分別為2.877、3.205、3.421，P<0.05)。4周后，腫瘤重量也明顯減少(t= 3.151，P<0.05)，見圖7。

圖6 流式細胞術(shù)檢測CT26的凋亡

*：P<0.05，與NC組相比

3 討論

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞及細胞外基質(zhì)中的非細胞成分，其中巨噬細胞不僅參與固有免疫應(yīng)答，還可通過抗原提呈作用介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答[7]。但是越來越多的研究表明，在癌癥的中后期，巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境的馴化下，可極化為與M2型巨噬細胞類似的腫瘤相關(guān)巨噬細胞，其抗原提呈能力減弱，進而發(fā)揮免疫抑制功能，促進腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移[8]。同時腫瘤相關(guān)巨噬細胞還分泌大量的細胞因子抑制T細胞的活性進而影響其發(fā)揮抗腫瘤免疫。此外，腫瘤相關(guān)巨噬細胞還分泌多種趨化因子，募集更多的巨噬細胞到達腫瘤部位促進腫瘤發(fā)展[9]。有研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細胞的數(shù)量與結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)，減少腫瘤相關(guān)巨噬細胞的數(shù)量可抑制腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移[10]。

LncRNA作為一類不編碼蛋白質(zhì)且長度超過200個核苷酸的RNA分子，一直被認為是轉(zhuǎn)錄組的“噪音”，近年來大量研究表明，lncRNA具有許多生物學功能，可以調(diào)控細胞的分化和發(fā)育[11]。關(guān)于lncRNA調(diào)控巨噬細胞分化仍不明確。我們先期的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)結(jié)腸癌細胞CT26培養(yǎng)上清液刺激，巨噬細胞可高表達lincRNA-p21，由此推測lincRNA-p21可調(diào)控巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化。有文獻報道，lincRNA-p21位于調(diào)節(jié)細胞周期的p21基因的上游，可調(diào)控細胞增殖、凋亡和DNA損傷，是p53的轉(zhuǎn)錄靶標[12]。同時lincRNA-p21也可通過募集不均一核糖核蛋白K至p21啟動子處，調(diào)控p21的表達[13]。但是關(guān)于lincRNA-p21調(diào)控巨噬細胞分化還鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制巨噬細胞中l(wèi)incRNA-p21的表達后，再與結(jié)腸癌細胞共培養(yǎng)可促進結(jié)腸癌細胞的凋亡，同時也可抑制結(jié)腸癌細胞的遷移能力。動物實驗的結(jié)果也顯示，抑制巨噬細胞lincRNA-p21的表達可有效延緩荷瘤小鼠腫瘤的生長。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21具有潛在調(diào)控巨噬細胞分化的功能，抑制其表達，可促進巨噬細胞發(fā)揮抗腫瘤免疫，促進腫瘤細胞的凋亡。但lincRNA-p21調(diào)控巨噬細胞發(fā)生極化和促進腫瘤細胞凋亡的機制尚不明確，仍需進一步研究。