曹媛媛，李桂成，鄧加雄，李云峰，段智

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，郴州 423000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是膿毒癥的常見(jiàn)并發(fā)癥，但因其缺乏有效的治療手段，在臨床上具有較高的病死率。研究證實(shí)，肺泡上皮線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制，因此維護(hù)線粒體穩(wěn)定可以顯著改善ALI[1]。線粒體自噬是指細(xì)胞通過(guò)選擇性自噬清除受損或功能紊亂的線粒體以維持正常線粒體質(zhì)量或功能[2，3]的現(xiàn)象，該作用已在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等方面的疾病中被證實(shí)[4-6]，但在肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用研究較為鮮見(jiàn)。在本研究中我們通過(guò)H2O2的氧化應(yīng)激作用介導(dǎo)肺泡上皮損傷細(xì)胞模型，探討虎杖苷是否通過(guò)上調(diào)線粒體自噬減輕肺泡上皮線粒體損傷，從而闡述線粒體自噬在ALI發(fā)病中的重要作用，為臨床治療ALI尋找可能靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熒光素-熒光素酶試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；膜電位JC-1探針及鈣黃綠素-氯化鈷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針購(gòu)自上海碧云天公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (cell count kit-8,CCK-8)購(gòu)自上海Dojindo公司；線粒體膜蛋白[線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of inner mitochondrial membrane 23,TIM23)]，及線粒體生成調(diào)節(jié)因子[線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mitochondrial transcription factor A,mTFA)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α, PGC-1α)]單克隆抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢ABclonal公司；mt-Keima-COX8慢病毒滴度液購(gòu)于南京PPL公司；A549細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物公司。

1.2 分組及處理

將A549細(xì)胞分為4組(n=6)：對(duì)照組細(xì)胞僅接受0.1%濃度的DMSO處理60 min；模型組細(xì)胞同等濃度DMSO預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min[7]；治療組細(xì)胞接受虎杖苷50 μmol/L[3]預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min；抑制劑組細(xì)胞接受線粒體自噬抑制劑mdivi-1 10 μmol/L[3]及虎杖苷50 μmol/L預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min。

1.3 線粒體自噬水平檢測(cè)

(1)通過(guò)Western blotting檢測(cè)TOM20(1∶2 000)、TIM23(1∶2 000)、mTFA(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)表達(dá)水平。細(xì)胞充分裂解，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。(2)參照既往研究[3]，采用Keima法檢測(cè)線粒體自噬，按照說(shuō)明書(shū)操作將mt-Keima-COX8慢病毒滴度液與細(xì)胞共同孵育48 h，并以Puromycin藥物篩選后穩(wěn)定傳代。4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，置于共聚焦顯微鏡下觀察。綠色熒光代表未發(fā)生自噬的線粒體，紅色熒光代表發(fā)生自噬的線粒體，以紅色/綠色熒光面積作為線粒體自噬水平。

1.4 線粒體膜電位測(cè)定

4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后經(jīng)PBS洗后重懸，與JC-1(工作濃度為5 μmol/L)在37℃孵育15 min 后共聚焦顯微鏡下觀察并記錄數(shù)據(jù)。以紅色/綠色熒光的比值來(lái)衡量線粒體去極化的程度，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。比值越高表明線粒體去極化降低，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)增加，反之則去極化增加，MMP下降。

1.5 ROS檢測(cè)

采用DCFH-DA ROS熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后與5 μmol/L濃度的DCFH-DA工作液在37℃下共孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。

1.6 細(xì)胞ATP含量測(cè)定

采用熒光素-熒光素酶法檢測(cè)線粒體ATP水平。將細(xì)胞懸液加入96孔白板，每孔100 μl(約2×104個(gè)細(xì)胞)。于室溫下加入等體積CellTiter-Glo檢測(cè)試劑，混勻細(xì)胞，并孵育10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組A值，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 細(xì)胞活性檢測(cè)

在96孔板中接種200 ul的細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)過(guò)不同條件處理后棄上清，加入10 μl CCK-8溶液及培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀上檢測(cè)A值，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組細(xì)胞線粒體自噬水平比較

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞TOM20及TIM23表達(dá)顯著下降，提示發(fā)生線粒體自噬；與模型組比較，治療組TOM20及TIM23表達(dá)顯著下降，提示線粒體自噬增強(qiáng)；與治療組比較，抑制劑組TOM20及TIM23表達(dá)顯著增加，提示mdivi-1抑制了虎杖苷上調(diào)的線粒體自噬，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。為排除線粒體生成下降對(duì)線粒體自噬的影響，我們檢測(cè)了用以反映線粒體生成的mTFA及PGC-1α。結(jié)果顯示，4組細(xì)胞mTFA及PGC-1α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)Keima法進(jìn)一步檢測(cè)并驗(yàn)證線粒體自噬水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著增加，提示發(fā)生線粒體自噬；與模型組比較，治療組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著增加，提示線粒體自噬增強(qiáng)；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著減小，提示線粒體自噬被抑制(圖1，表1)。

圖1 4組細(xì)胞線粒體自噬結(jié)果

表1 4 組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白比較

TOM20: translocase of outer mitochondrial membrane 20; TIM23: translocase of inner mitochondrial membrane 23; mt-TFA: mitochondrial transcription factor A; PGC-1α: peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Compared with control group,*P<0.05; compared with model group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.2 4組細(xì)胞MMP比較

對(duì)照組、模型組、治療組與抑制劑組MMP分別為(100.0±5.9)%、(54.2±4.8)%、(70.8±3.6)%和(56.0±6.1)%。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP顯著下降，治療組MMP較模型組顯著增加，而抑制劑組MMP較治療組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖2)。

圖2 JC-1法檢測(cè)4組細(xì)胞MMP結(jié)果

MMP: mitochondrial membrane potential; JC-1: 5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide.

2.3 4組細(xì)胞ROS水平比較

對(duì)組組、模型組、治療組與抑制劑組細(xì)胞ROS水平分別為(100.0±5.2)%、(213.0±20.1)%、(173.0±15.9)%和(201.5±17.5)%。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ROS水平顯著上升；與模型組比較，治療組ROS水平顯著下降；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞ROS水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖3)。

圖3 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞ROS水平結(jié)果

2.4 4組細(xì)胞ATP和活性水平比較

對(duì)照組、模型組、治療組及抑制劑組ATP分別為(100.0±4.3)%、(70.8±6.3)%、(82.7±4.2)%和(71.3±5.2)%；細(xì)胞活性依次是(100.0±3.8)%、(73.2±4.4)%、(82.7±6.3)%和(74.1±4.8)%。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活性、ATP水平顯著下降；與模型組比較，治療組細(xì)胞活性、ATP水平顯著增加；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞活性、ATP水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

線粒體是普遍存在于真核生物的細(xì)胞器，有細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”之稱[8]，在氧化應(yīng)激、細(xì)胞信息傳遞、代謝調(diào)節(jié)及內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]。研究證實(shí)，肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制，線粒體可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)參與ALI[1,3]。因此，維持線粒體功能正常是可能治療ALI的方法之一[9,10]。線粒體自噬指細(xì)胞線粒體發(fā)生去極化損傷，損傷線粒體被特異性包裹進(jìn)自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成損傷線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。研究表明上調(diào)線粒體自噬可以減輕百草枯介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡[11]。而抑制絲裂原活化蛋白激酶3表達(dá)可以減輕ALI，這可能與其上調(diào)線粒體自噬有關(guān)[12]。我們以往證實(shí)，虎杖苷可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)減輕脂多糖介導(dǎo)的ALI，但機(jī)制尚未明確[2]。基于以上研究，本研究假設(shè)并探討了虎杖苷是通過(guò)上調(diào)線粒體自噬減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以顯著抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞ROS水平上升及細(xì)胞活力下降。另外，TOM20及TIM23是線粒體膜蛋白，只存在于線粒體中，當(dāng)線粒體自噬增強(qiáng)時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平下降[3]。為檢測(cè)虎杖苷對(duì)線粒體自噬的影響，我們檢測(cè)了線粒體質(zhì)量蛋白TOM20及TIM23，結(jié)果顯示虎杖苷可以下調(diào)TOM20及TIM23表達(dá)，即增強(qiáng)了線粒體自噬水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，被廣泛應(yīng)用為線粒體自噬抑制劑的mdivi-1[3]可以顯著抑制虎杖苷誘導(dǎo)的自噬保護(hù)作用。這些結(jié)果表明虎杖苷可能通過(guò)上調(diào)線粒體自噬水平發(fā)揮保護(hù)作用。mTFA是線粒體轉(zhuǎn)錄因子，在線粒體DNA的復(fù)制和線粒體生成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用；PGC-1α是共激活轉(zhuǎn)錄因子成員，可調(diào)控線粒體生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)線粒體生成；在以往研究中通過(guò)檢測(cè)mTFA及PGC-1α表達(dá)可以反映線粒體生成[3]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)虎杖苷不會(huì)引起mTFA及PGC-1α表達(dá)的變化，因而排除了因線粒體生成下降造成TOM20及TIM23表達(dá)下降的可能。另外我們還通過(guò)Keima法檢測(cè)線粒體自噬變化。Keima蛋白定位于線粒體基質(zhì),當(dāng)線粒體自噬體與酸性溶酶體融合后Keima蛋白的熒光信號(hào)由綠色轉(zhuǎn)為紅色，因此通過(guò)熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)換可定量反映線粒體自噬的水平。結(jié)果顯示虎杖苷可以增強(qiáng)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體自噬，而mdivi-1可以抑制虎杖苷對(duì)線粒體自噬的增強(qiáng)作用。

線粒體自噬通過(guò)清除損傷的線粒體維持線粒體正常功能，我們進(jìn)一步檢測(cè)了虎杖苷對(duì)線粒體功能的影響。線粒體功能不全通常是由于線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放引起[13]。正常線粒體處于電壓內(nèi)負(fù)外正的極化狀態(tài)，這種跨膜電位是線粒體合成ATP必備的電壓驅(qū)動(dòng)力。我們結(jié)果顯示虎杖苷顯著抑制了氧化應(yīng)激介導(dǎo)的MMP下降，而這種保護(hù)作用可以被mdivi-1顯著抑制。另外，線粒體是ATP生成的主要細(xì)胞器，我們還檢測(cè)了細(xì)胞ATP水平以反映線粒體功能的變化。結(jié)果顯示虎杖苷可以顯著抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ATP水平下降，同樣，這種保護(hù)作用被mdivi-1抑制。

總之，我們的研究認(rèn)為虎杖苷可能通過(guò)上調(diào)線粒體自噬水平以減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體損傷，而抑制線粒體自噬可以顯著降低虎杖苷的保護(hù)作用。