溫 爽，劉天卿，王紅龍

(大連市友誼醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116001)

透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)是腎細(xì)胞癌的常見(jiàn)類(lèi)型，其發(fā)病率逐年增加[1-2]。伴隨影像技術(shù)的進(jìn)步，小的CCRCC病灶在確診病例比例中高達(dá)60%～80%，然而數(shù)據(jù)顯示，病灶小的局限性CCRCC中仍然有20%～30%的腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移。因此，預(yù)測(cè)CCRCC患者的預(yù)后，實(shí)施針對(duì)性的術(shù)后治療，才能延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。目前尚無(wú)有效判斷CCRCC患者預(yù)后的分子，尋找影響CCRCC預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物有助于我們?cè)u(píng)估患者預(yù)后[3]。

泛素-蛋白酶系統(tǒng)是人體蛋白質(zhì)降解的主要途徑，可以選擇性降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄及增殖。該系統(tǒng)降解蛋白的過(guò)程是多步驟的反應(yīng)，需要包括泛素、泛素連接酶等多種蛋白質(zhì)的參與，其中的泛素連接酶以F-box蛋白為亞基識(shí)別靶蛋白。在F-box蛋白家族中，F(xiàn)BXO11蛋白是重要成員之一，可選擇性識(shí)別靶蛋白并對(duì)其進(jìn)行泛素化和蛋白酶水解，F(xiàn)BXO11蛋白表達(dá)異常與一些疾病的發(fā)生相關(guān)[4-6]。有研究顯示，在一些惡性腫瘤中FBXO11蛋白表達(dá)下調(diào)，無(wú)法降解誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的Snail蛋白，致使腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)方向分化，腫瘤進(jìn)展并轉(zhuǎn)移[7]。也有學(xué)者認(rèn)為FBXO11作為腫瘤抑制基因TP53的NEDD8連接酶可以介導(dǎo)P53蛋白[8]的內(nèi)磷酸化和轉(zhuǎn)錄失活，致使P53失去抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，促進(jìn)乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，與患者預(yù)后較差相關(guān)。FBXO11在CCRCC中的表達(dá)與CCRCC患者臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究檢測(cè)了77例CCRCC組織和35例癌旁正常腎組織FBXO11蛋白的表達(dá)情況，分析FBXO11蛋白表達(dá)與CCRCC臨床病理特征，特別是患者總生存期的關(guān)系，探討FBXO11蛋白表達(dá)在判斷CCRCC進(jìn)展及患者預(yù)后中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

所有CCRCC標(biāo)本均來(lái)自2003—2015年大連市友誼醫(yī)院確診的病例，共77例，其中男53例，女24例，平均年齡61歲(26～86歲)；腫瘤直徑1.3～17.0 cm，≤7 cm者55例，>7 cm者22例。所有患者術(shù)前、術(shù)后均未接受過(guò)放療或化療。腫瘤分級(jí)由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生根據(jù)2016版WHO分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立完成[9]。其中G1和G2級(jí)59例，G3和G4級(jí)18例；T1和T2期64例，T3和T4期13例；無(wú)靜脈癌栓者66例，有靜脈癌栓者11例；無(wú)轉(zhuǎn)移者60例，有轉(zhuǎn)移者17例。電話隨訪所有病例，計(jì)算患者的總生存時(shí)間，起點(diǎn)為手術(shù)日期，終點(diǎn)為患者死亡日期和隨訪截止日期，以月為單位計(jì)算，最后隨訪日期為2015年12月。平均所有患者隨訪27.1個(gè)月(3～72個(gè)月)。癌旁正常腎組織35例，其中女性患者11例，男性患者24例，平均年齡60歲(45～84歲)。

1.2 方 法

標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后常規(guī)石蠟包埋，行4 μm連續(xù)切片，免疫組化專(zhuān)用過(guò)膠片撈片，60 ℃烤片1 h。免疫組化采用Max Vision法。一抗FBXO11(克隆號(hào)：ab110965)，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。PBS、過(guò)氧化物酶、二抗、DAB顯色劑試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。染色方法按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒記為陽(yáng)性細(xì)胞，當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比值≥40%為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將臨床資料及所得結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用chi-Square檢驗(yàn)評(píng)估FBXO11蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用COX單因素分析判斷CCRCC患者性別、年齡，腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤分期、有無(wú)靜脈內(nèi)癌栓、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及FBXO11蛋白表達(dá)8項(xiàng)因素中影響CCRCC患者總生存期(overall survival，OS)縮短的因素。將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素引入COX多因素模型，分析影響CCRCC患者OS縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 FBXO11蛋白在CCRCC及癌旁正常組織中的表達(dá)

FBXO11蛋白在CCRCC細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。FBXO11蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在CCRCC與癌旁正常組織中分別為48.1%與25.7%，在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 FBXO11蛋白表達(dá)與CCRCC患者臨床病理特征的關(guān)系

FBXO11蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在無(wú)靜脈內(nèi)癌栓與有靜脈內(nèi)癌栓組分別為39.4%與72.7%，無(wú)靜脈內(nèi)癌栓組明顯低于有靜脈內(nèi)癌栓組(P<0.05)；在不同性別、年齡、腫瘤最大徑間無(wú)顯著性差異(P均>0.05)；在組織學(xué)分級(jí)G1～G2與G3～G4組分別為47.5%與50.0%，兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在腫瘤分期T1～T2與T3～T4組分別為46.9%與53.8%，兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組分別為46.7%與52.9%，兩組間亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

A:正常腎小管中FBXO11蛋白陰性表達(dá)；B、C: CCRCC中FBXO11蛋白陽(yáng)性表達(dá)圖1 正常腎小管及CCRCC中FBXO11蛋白的免疫組化染色結(jié)果(×400) Fig 1 Results of immunohistochemical staining of FBXO11 protein in renal tubule and CCRCC(×400)

表1 CCRCC中FBXO11蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 患者臨床病理特征及FBXO11蛋白表達(dá)與CCRCC患者OS的關(guān)系

2.3.1 COX單因素分析

將CCRCC患者性別、年齡，腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤分期、有無(wú)靜脈內(nèi)癌栓、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及FBXO11蛋白表達(dá)8項(xiàng)因素進(jìn)行COX單因素分析。分析結(jié)果顯示，高組織學(xué)分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高表達(dá)FBXO11蛋白是影響CCRCC患者OS縮短的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。CCRCC患者生存分析函數(shù)圖見(jiàn)圖2。

2.3.2 COX多因素分析

將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的3個(gè)因素即CCRCC高組織學(xué)分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高表達(dá)FBXO11蛋白引入COX多因素模型分析，結(jié)果顯示高表達(dá)FBXO11是影響CCRCC患者OS縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

盡管大部分CCRCC經(jīng)外科手術(shù)能夠獲得較好的預(yù)后，但仍然有30%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而且臨床研究顯示少部分CCRCC盡管腫瘤病灶很小，也可能具有高度惡性的生物學(xué)行為，會(huì)在手術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此評(píng)估腫瘤進(jìn)展情況對(duì)CCRCC患者的治療及判斷預(yù)后很有必要。目前仍未發(fā)現(xiàn)能夠靈敏且特異地提示CCRCC侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注FBXO11蛋白在腫瘤進(jìn)展中的作用及其對(duì)患者預(yù)后判斷的潛力。目前有關(guān)FBXO11與CCRCC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的研究很少。

A：組織學(xué)分級(jí)。1：高級(jí)別；2：低級(jí)別；B：有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。1：無(wú)；2：有；C：FBXO11蛋白表達(dá)。1：低表達(dá)；2：高表達(dá)圖2 CCRCC患者生存分析函數(shù)圖Fig 2 Survival analysis in CCRCC patients

表2 COX多因素分析

FBXO11基因最初被定義為白癜風(fēng)基因(VIT1)，它在白癜風(fēng)中表達(dá)下調(diào)[10]。FBXO11基因位于染色體2p21，編碼由843個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白的分子量為94 kDa。FBXO11是E3泛素連接酶復(fù)合物(也稱(chēng)為SCF復(fù)合物或CRL1FBXO11泛素連接酶)，可以特異性識(shí)別底物，在泛素-蛋白酶系統(tǒng)中介導(dǎo)蛋白酶降解特定的底物，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與基因組穩(wěn)定性的主要因子[11-12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)FBXO11在CCRCC中的表達(dá)高于正常腎組織，并且發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶[13]。本研究顯示在CCRCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.1%，明顯高于癌旁正常腎組織中的25.7%，這提示FBXO11可能在CCRCC的發(fā)生中有一定的作用。本研究中FBXO11蛋白表達(dá)在有靜脈癌栓的腫瘤明顯高于無(wú)癌栓的，說(shuō)明該蛋白可能參與并促進(jìn)CCRCC的進(jìn)展和演進(jìn)。FBXO11可通過(guò)多種方法調(diào)節(jié)腫瘤形成及進(jìn)展，例如抑制凋亡、促進(jìn)EMT和抑制血管生成。研究發(fā)現(xiàn)FBXO11能介導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-6的泛素化，使Bcl-6在泛素-蛋白酶系統(tǒng)的作用下被降解。在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中，F(xiàn)BXO11基因一般是缺失或突變的，它無(wú)法降解Bcl-6蛋白，導(dǎo)致Bcl-6蛋白聚集，細(xì)胞凋亡減少，腫瘤發(fā)生并進(jìn)展[14]。免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示，在胃癌中FBXO11通過(guò)PI3K/AKT通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[15]。當(dāng)FBXO11的泛素連接酶活性不穩(wěn)定時(shí)，能夠抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)合成，抑制血管生成，從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受[16-17]。CCRCC中高表達(dá)的FBXO11蛋白是否也通過(guò)上述一種或幾種方式促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展有待進(jìn)一步研究。

目前的研究發(fā)現(xiàn)在一些癌癥中FBXO11蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后差。在骨肉瘤中FBXO11介導(dǎo)具有抑癌作用miR-376a的酶解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡，與患者OS縮短相關(guān)，F(xiàn)BXO11可能成為骨肉瘤患者判斷預(yù)后的預(yù)測(cè)因子及靶向治療的靶點(diǎn)[18]。在胃癌中FBXO11的過(guò)度表達(dá)與腫瘤體積大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期高有關(guān)，而且FBXO11高表達(dá)的胃癌患者的OS顯著縮短[15]。在一項(xiàng)肺腺癌細(xì)胞研究中，敲除FBXO11基因后，其蛋白表達(dá)水平降低，而EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白表達(dá)卻隨之升高，腫瘤細(xì)胞的遷移力顯著增加，這可能由于增加的Snail蛋白通過(guò)抑制 E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，改變癌細(xì)胞的表型和降低細(xì)胞間的黏附，使腫瘤細(xì)胞獲得更大的遷移能力，并且誘導(dǎo)基底膜屏障破壞和EMT發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲[19]。然而也有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)BXO11蛋白也可以發(fā)揮抑癌的作用。在乳腺癌和肺癌中FBXO11能介導(dǎo)泛素-蛋白酶系統(tǒng)泛素化并酶解EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail，使癌細(xì)胞內(nèi)的Snail蛋白水平下降，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，抑制腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移[6,8]。FBXO11不僅可以直接泛素化并酶解靶蛋白，同時(shí)也能間接地抑制靶蛋白的功能。比如，F(xiàn)BXO11能促進(jìn)NEDD8與P53的結(jié)合，抑制P53的轉(zhuǎn)錄，從而抑制P53的功能[20]。本研究的單因素分析顯示高表達(dá)FBXO11蛋白與患者OS縮短相關(guān)，且多因素分析提示高表達(dá)FBXO11蛋白是CCRCCC患者OS縮短的獨(dú)立預(yù)后因素。以上結(jié)果提示高表達(dá)FBXO11與CCRCCC患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究認(rèn)為FBXO11可能參與了CCRCC的進(jìn)展和演進(jìn)。因此，F(xiàn)BXO11對(duì)判斷CCRCC患者預(yù)后可能有一定臨床意義。

FBXO11蛋白高表達(dá)是CCRCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，提示其作為不良預(yù)后因子和潛在的治療靶點(diǎn)可行性。然而要將其應(yīng)用于臨床還需多中心、大規(guī)模的研究及長(zhǎng)期隨訪來(lái)證明其可行性及有效性。