于 欣，于美玲，馬全萍，戴亞東，楊 震

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。在2000年，兩個獨立的研究小組從心臟移植受體的外植心臟制備的人心臟左心室cDNA文庫和人淋巴瘤cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的同源物ACE2[1-2]。目前研究[3]表明，ACE2不僅和動脈粥樣硬化、高血壓有關(guān)，也與心律失常有關(guān)。筆者利用生物信息學(xué)一些軟件分析ACE2不同特點，為研究其在臨床常見疾病如心血管疾病發(fā)生與發(fā)展、治療提供了思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲?。涸跀?shù)據(jù)庫https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/檢索從而獲得人的ACE2蛋白序列(Genbank：BAB40370.1)。

1.2 研究方法：①采用在線獲取生物信息學(xué)軟件protparam，用該軟件分析ACE2蛋白的物理、化學(xué)特性；獲得在線軟件ProtScale并用其分析ACE2蛋白疏水性。②利用軟件SignalP 4.0分析ACE2信號肽。首先輸入前70個氨基酸，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型NN和隱馬爾可夫模型HMM進(jìn)行預(yù)測，一般包括三個值：S-score、C-score和Y-score。S-score：每個氨基酸對應(yīng)1個S值，在結(jié)果顯示的圖標(biāo)中有一個曲線顯示S值的變化趨勢，利用S平均值來判斷分泌蛋白：若S平均值>0.5，則為分泌蛋白，且存在信號肽。C-score：剪切位點的值，在剪切位點處的C值是最高的。每個氨基酸會有一個C值，在剪切位點處的C值是最高的。Y-score：Y值是綜合考慮S值和C值的一個參數(shù)，其比單獨考慮C值要精準(zhǔn)，因為在一系列中C值可能有不止一個較高的位點，但是剪切位點只有一個；此時的剪切位點就由Y-max值來推測，S值是陡峭的位值和具有高C值的位點，即剪切點。通過Y最大值來判斷信號肽剪切位點。③用軟件TMHMM 2.0Sever對ACE2跨膜結(jié)構(gòu)相關(guān)生物信息特點進(jìn)行預(yù)測。④利用TargetP、PSORTⅡ軟件等全面綜合分析其亞細(xì)胞定位；ACE2入在線亞細(xì)胞定位生物信息工具TargetP，在序列來源項選擇noplant，其他選項用默認(rèn)值，大體預(yù)測ACE2蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布情況，進(jìn)一步采用PSORTⅡ軟件的the k-NN Prediction參數(shù)下進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位檢測。⑤根據(jù)NetPhos2.0和NetOGlyc3.1分別對其磷酸化位點和糖基化位點進(jìn)行預(yù)測和分析。⑥利用生物信息學(xué)Smart軟件和DNAStar軟件分別對ACE2保守結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)及抗原系數(shù)進(jìn)行預(yù)測、分析。⑦Human protein atlas數(shù)據(jù)庫檢索ACE2，進(jìn)行蛋白預(yù)測。所有在線工具網(wǎng)址見文獻(xiàn)[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 ACE2蛋白的物理、化學(xué)特性：ACE2蛋白由805個氨基酸組成，分子式為C4170H6358N1094O1222S35，其相對分子質(zhì)量是92 491.05，理論等電點pI是5.36。在構(gòu)成ACE2蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，為9.4%，而半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)含量較少，分別占1.0%和2.0%，未發(fā)現(xiàn)吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。帶負(fù)電荷氨基酸殘基[天冬氨酸+谷氨酸(Asp+Glu)]數(shù)為99，帶正電荷氨基酸殘基[精氨酸+賴氨酸(Arg+Lys)]數(shù)為78，不穩(wěn)定系數(shù)為40.10。脂溶指數(shù)為80.55，屬于脂溶性蛋白；總平均親水性為-0.376。

2.2 ACE2蛋白信號肽：結(jié)果顯示，ACE2蛋白N端第15～35位氨基酸的疏水性短肽區(qū)域可引導(dǎo)蛋白質(zhì)的肽鏈通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入腔內(nèi)，我們預(yù)測此疏水性短肽區(qū)域為信號肽。預(yù)測表明，C預(yù)測Max值為0.427，Y預(yù)測Max值為0.586，S結(jié)果Max值為0.950，其剪切位點在29～30個氨基酸位置上，且S平均值為0.821。

2.3 ACE2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測：膜蛋白分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)就是蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的部分，有的蛋白有一個或多個跨膜區(qū)。結(jié)果表明，ACE2蛋白是由一個跨膜區(qū)(第741～763位氨基酸)、胞外區(qū)(第1～740位氨基酸)以及胞內(nèi)區(qū)(第764～805位氨基酸)構(gòu)成的膜蛋白。

2.4 ACE2蛋白的亞細(xì)胞定位檢測結(jié)果：結(jié)果顯示，ACE2蛋白分子屬于分泌蛋白，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.5%)、高爾基體(33.3%)、漿膜(22.2%)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.5 ACE2蛋白翻譯后修飾位點分析：NetPhos2.0結(jié)果表明，ACE2蛋白有13個Ser、8個Thr、14個酪氨酸(Tyr)可能成為蛋白激酶磷酸化位點。NetOGlyc3.1顯示在位點22、26、108預(yù)測分值大于0.5，標(biāo)記為陽性。

2.6 ACE2蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)多指多肽鏈中的主鏈借助氫鍵(H)形成有規(guī)則卷曲折疊的一維構(gòu)象。本研究利用DNAstar網(wǎng)絡(luò)檢測ACE2蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位，綜合Gamien-Robson和Chou-Famsman2兩種方法，發(fā)現(xiàn)ACE2的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)(44.5%和39.1%)、β折疊(35.3%和23.6%)、轉(zhuǎn)角(10.1%和31.8%)和無規(guī)則卷曲(10.6%)。根據(jù)Jameson woff預(yù)測ACE2的氨基酸，區(qū)段137-138、289、354-355、492-493、690-691、789-790、800區(qū)域抗原指數(shù)較高，其他部位的預(yù)測值表現(xiàn)較低甚至為負(fù)值。綜合分析發(fā)現(xiàn)除第30～56外，其他區(qū)域親水性和氨基酸表面表現(xiàn)指數(shù)偏低，推測此區(qū)域可能是該蛋白的優(yōu)勢抗原表位。

2.7 ACE2蛋白表達(dá)及相互作用：通過在線檢索(http：string-db.org)查詢出ACE2相互作用的蛋白，通過Human protein atlas數(shù)據(jù)庫檢索，ACE在十二指腸、膽囊、腎臟、睪丸等器官組織中蛋白表達(dá)較高。

3 討論

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的同源物，本研究protparam結(jié)果、表明ACE2是一種脂溶性的跨膜蛋白，具有羧肽酶催化活性的跨膜糖蛋白，主要由三部分組成：42個氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾端、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外金屬蛋白酶鋅結(jié)合域；ProtScale疏水性分析結(jié)果表明，ACE2蛋白多肽鏈第757號分值最高(3.778，疏水性最強(qiáng))，第771號分值最低(-3.311，親水性極強(qiáng))；比較親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域，發(fā)現(xiàn)親水性區(qū)域面積明顯大于疏水性區(qū)域，提示ACE2蛋白是一種親水性蛋白。SignalP預(yù)測結(jié)果顯示信號肽區(qū)域的S值較高，判斷它具有分泌信號肽。在真核生物中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中常見兩種情況，如糖基化、磷酸化。糖基化多數(shù)是指修飾天冬酰胺(Asn)上的N端，通常糖基化的氨基酸特征序列多為Asn-X-絲氨酸(Ser)-蘇氨酸(Thr)，X可表示為任一種氨基酸。磷酸化多數(shù)具有功能啟動和關(guān)閉作用。NetPhos2.0和NetOGlyc3.1結(jié)果表明ACE2存在磷酸化和糖基化，于是這些提示機(jī)體中ACE2可能需要糖分子/糖鏈等與其他生物分子相互作用發(fā)揮其生物學(xué)作用，同時它被磷酸化后才能具備調(diào)控生物體某種功能代謝的作用。

從Human protein atlas數(shù)據(jù)庫看出，ACE2的表達(dá)具有一定局限性和高度的組織特異性，從而提示了ACE2在高表達(dá)部位，如心血管、腎臟疾病中具有治療潛力。如果ACE2磷酸化和糖基化，它的上下游底物有哪些？從本研究可以看出ACE2可以參與體內(nèi)很多通路，和很多蛋白發(fā)生密切關(guān)系，如PRCP、AGT、MME等等。ACE2可分別作用于血管緊張素Ⅰ(Angiotensin，AngⅠ)和 AngⅡ，且對Ang Ⅱ的催化效率是對AngⅠ的400倍，生成重要的舒血管物質(zhì)血管緊張素1-7[6](Angiotensin 1-7，Ang1-7)。有研究已經(jīng)確認(rèn)ACE2是RAS的一個重要的內(nèi)源性負(fù)調(diào)控器，它能夠減輕AngⅡ和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)介導(dǎo)的有害行為[7]。通過抑制ACE-AngⅡ-AT1R軸減少對器官組織的炎性損傷，具有拮抗和平衡ACE的作用[8-10]，抑制經(jīng)典RAS系統(tǒng)。Mas是Ang(l-7)的功能性受體，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞是ACE2發(fā)揮生物學(xué)作用的主要部位，目前對于ACE2、Ang(1-7)的探索尚在初期階段，可能為心血管等相關(guān)性疾病的治療提供新的靶點；隨著對ACE2-Ang(1-7)-Mas(受體)軸研究的深入，臨床選用新軸的各成分為基礎(chǔ)作為治療方向，勢必會給心血管疾病的治療注入新的活力。綜上所述，ACE2也豐富了我們對ACE2-Ang(1-7)-Mas系統(tǒng)的理論認(rèn)識。

通過認(rèn)識ACE2的生理特性及其主要生物學(xué)信息研究，為深入開展人ACE2蛋白的酶學(xué)特性和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供理論參考。希望通過ACE2的預(yù)測分析研究，充實ACE2的藥理學(xué)作用機(jī)制，從而推動ACE2抑制劑及其候選藥物的研究開發(fā)，為相關(guān)藥物的治療提供新的靶點。