孫金龍，師希雄*，黃 峰，韓 玲，陳 騁，岳建偉

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

藏羊是我國原始綿羊品種之一，分布廣泛，在家畜中所占比重較大[1]。歐拉藏羊是藏羊的主要品種之一，主要生長在甘肅、青海、西藏等青藏高原的高海拔地區(qū)，特殊的生長環(huán)境造就了歐拉藏羊耐高寒、個體高大和生長較快速的特點[2]。并且歐拉藏羊肉味道鮮美、風(fēng)味獨特，具有良好的營養(yǎng)和食用品質(zhì)[3]。但粗放的飼養(yǎng)方式同時也導(dǎo)致歐拉藏羊肉的纖維較粗，使得其肉嫩度較差，嚴重制約了肉品加工領(lǐng)域?qū)W拉藏羊肉的開發(fā)和利用。因此，改善歐拉藏羊肉嫩度、提高其食用品質(zhì)，對歐拉藏羊肉的生產(chǎn)加工具有重要意義。

成熟是肌肉在宰后發(fā)生的重要生理性變化，在此過程中，肌肉的嫩度、色澤、保水性和風(fēng)味均會得到改善[4]。其中，成熟過程對肌肉嫩度的影響最大。國內(nèi)外研究報道指出，宰后成熟嫩化主要歸因于內(nèi)源性蛋白酶對肌原纖維蛋白的有限降解[5-7]。肉中肌原纖維蛋白的降解破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)，在很大程度上改善了肉的嫩度，進而提高了肌肉的食用品質(zhì)[8]。但是，目前肉的成熟嫩化機理尚未明確。動物屠宰后，缺血、缺氧的應(yīng)激狀態(tài)不僅打破了肌肉的生理平衡，同時也刺激了小分子熱休克蛋白的表達。熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）是小分子熱休克蛋白的一種，經(jīng)常被用于小分子熱休克蛋白對細胞凋亡的相關(guān)研究。

至今，哺乳動物中鑒別出數(shù)十種小分子熱休克蛋白，它們普遍存在且在特殊組織內(nèi)表達[9]。Hsp20、Hsp27和αβ-結(jié)晶蛋白等小分子熱休克蛋白的表達水平均高于骨骼肌中其他蛋白質(zhì)，被認為是心肌肌肉嫩化的潛在因素[10]。

Morzel等報道Hsp27可維持肌原纖維的穩(wěn)定性，其表達量與牛肉的韌性呈負相關(guān)[11]。安格斯牛背最長肌中Hsp27表達量的下降有利于肌球蛋白和肌動蛋白的水解，進而提高了肌肉嫩度；且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低[12]。然而，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果中Hsp27和嫩度的關(guān)系并不一致。Contreras-Castillo等指出，肌原纖維結(jié)合的小分子熱休克蛋白可以作為μ-鈣激活酶替代基質(zhì)，并導(dǎo)致了肉的嫩化[13]。Hsp27與Caspase-3氨基末端的肽相互作用，為細胞凋亡效應(yīng)酶提供了一種新的調(diào)控機制[14]。以上研究指出，Hsp27可能通過影響μ-鈣激活酶和Caspase-3在心肌成熟過程中降低肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，但其具體機制仍需進一步探究。

總之，Hsp27對肌原纖維蛋白和細胞凋亡酶的影響研究結(jié)果不一致。目前，關(guān)于歐拉藏羊肉宰后成熟過程中Hsp27的作用鮮有報道。因此，本實驗利用Hsp27的抑制劑（KRIBB3）對歐拉藏羊背最長肌進行處理，在相應(yīng)時間點取樣，并對肌原纖維蛋白的降解特性和細胞凋亡酶活力進行測定，探討Hsp27對肌原纖維蛋白降解及細胞凋亡酶活力的影響，以闡明Hsp27對羊肉的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3～4 歲的歐拉藏羊6 只，體質(zhì)量相近，生理成熟度等指標(biāo)基本相似，采自甘南安多畜牧有限公司。參考國內(nèi)外對動物福利的相關(guān)要求，屠宰方式嚴格按照國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)操作進行，宰前保證藏羊健康狀況良好，宰后熱應(yīng)激波動幅度較小，跟腱吊掛，從半胴體上取下整條背最長肌作為實驗材料。

Caspase-3、Caspase-9酶活力試劑盒 北京麥瑞博生物科技有限公司；Hsp27抑制劑（KRIBB3）、Csapase-3重組蛋白、μ-鈣激活酶（活力6 000 U）英國Abcam公司；蛋白Marker、Hsp27標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白一抗、二抗 北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒美國Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FA2004B電子天平 上海佑科儀器有限公司；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；iMark全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；WH-600-LCD型電泳儀 北京市六一儀器廠；脫色搖床 海門其林貝爾儀器制造公司；凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司；-80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

在屠宰后0.5 h內(nèi)取下背最長肌，剔除脂肪和結(jié)締組織膜，將0 d和體外模擬實驗的樣品切成5 g大小，用錫箔紙包裹迅速裝入液氮中運回實驗室，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。實驗組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋，按固液比1∶2注入提前準(zhǔn)備好的30 mmol/L KRIBB3溶液，4 ℃下快速運回實驗室并在4 ℃冰箱成熟，分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣，并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。對照組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋中，存放在干冰中快速運回實驗室轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱成熟，分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣，并測定Caspase-3、Caspase-9的活力以及免疫印跡等指標(biāo)，待測樣品轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 體外實驗

參考Ding Zhenjiang等的方法，略有改動[15]。取提取純化后的肌原纖維蛋白（0.5 g）7 份，編號為1～7，以加入10 μg蒸餾水的1號樣作為空白對照，2號樣加入10 μg Caspase-3處理，3號樣加入10 μg Caspase-3和6 μg Hsp27處理，4號樣加入10 μg μ-鈣激活酶處理，5號樣加入10 μg μ-鈣激活酶和6 μg Hsp27處理，6號樣用6 μg Hsp27處理，7號樣用10 μL 0.01 mol/L鈣離子處理，1～7號樣均在30 ℃下孵育2 h。對肌原纖維蛋白特性進行免疫印跡分析。

1.3.3 Caspase-3、Caspase-9活力測定

參考孫志昶等測定細胞凋亡酶活力的方法[16]。采用試劑盒測定Caspase-3、Caspase-9活力。準(zhǔn)確稱取待測肉樣10 mg，加入150 μL裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿30 次。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，冰浴5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，把上清液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的離心管中，在冰中保存待用。分別取Caspase-3、Caspase-9的檢測緩沖液40 μL、待測樣品50 μL，適當(dāng)混勻后，分別加入Caspase-3、Caspase-9底物Ac-DEVD-pNA、Ac-LEHD-pNA 10 μL，混勻后，在37 ℃下孵育2 h。待顏色發(fā)生明顯變化后測定其A405nm，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算活力。

1.3.4 MFI測定

肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）測定參考賈青的方法并稍作改進[17]。準(zhǔn)確稱取待測肉樣1 g，放入離心管中，加入10 mL MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、20 mmol/L K3PO4），用勻漿機100 000 r/min冰浴勻漿30 s，1 000hg離心15 min。棄去上清液，加入8 mL MFI緩沖液，100 000 r/min冰浴勻漿15 s，1 000hg離心15 min。棄去上清液，再加入10 mL MFI緩沖液，置于均質(zhì)機上振蕩，將上述溶液倒入200 目篩，過濾沉淀，利用雙縮脲法測定肌原纖維提取液內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度，再用MFI緩沖液調(diào)整肌原纖維提取液蛋白質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。將平均值代入公式（1）計算MFI。

1.3.5 肌原纖維蛋白提取及質(zhì)量濃度的測定

肌原纖維蛋白的提取采用Xia Xiufang等的方法并加以改進[18]。準(zhǔn)確稱取1 g肉樣，加入10 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.80），13 000 r/min勻漿10 s，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，沉淀用8 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液溶解后，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，重復(fù)兩次。沉淀用8 倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，重復(fù)兩次。沉淀中加4 mL 25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25），用雙縮脈法測定肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 肌原纖維蛋白溶解性測定

肌原纖維蛋白溶解性的測定參考Agyare等的方法并加以改進[19]。按1.3.5節(jié)方法提取肌原纖維蛋白并測定其質(zhì)量濃度。準(zhǔn)確稱取肌原纖維蛋白1 g，溶于50 mL質(zhì)量分數(shù)為0.75%的氯化鈉溶液中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 5.5，并在60 ℃水浴鍋中水浴加熱30 min，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取上清液，采用雙縮脲法測定離心前后上清液中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度，按式（2）計算肌原纖維蛋白溶解性。

1.3.7 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和免疫印跡分析

參考黃峰[20]的方法，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳使用質(zhì)量分數(shù)4%濃縮膠，肌間線蛋白分離膠質(zhì)量分數(shù)為10%，肌鈣蛋白-T分離膠質(zhì)量分數(shù)為12.5%。采用濕法轉(zhuǎn)印將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到膜上，轉(zhuǎn)印液含有20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、體積分數(shù)15%甲醇溶液。轉(zhuǎn)印條件為恒流200 mA，時間90 min。轉(zhuǎn)印后的聚偏二佛乙烯膜膜用含質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液（500 mmol/L NaCl、質(zhì)量分數(shù)0.05% Tween 20、30 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）室溫封閉1 h。與一抗在4 ℃下反應(yīng)過夜，然后用TBST溶液漂洗3 次，每次10 min，以去除未結(jié)合的一抗。然后把膜放入二抗中在室溫、避光條件下反應(yīng)60 min。在TBST溶液中漂洗3 次，每次10 min。使用ECL發(fā)光試劑盒在暗室中壓片、曝光。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本實驗的材料均進行3 組平行處理，用Origin 8.5軟件繪制柱狀圖，并用SPSS Statistics 20.0軟件進行誤差分析，用Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏羊肉宰后成熟過程中Caspase-3、Caspase-9活力變化

圖 1 Hsp27抑制劑對Caspase-3（A）、Caspase-9（B）活力的影響Fig. 1 Effect of Hsp27 inhibitor on caspase-3 (A) and caspase-9 (B) activity

由圖1A可知，對照組中Caspase-3活力隨著成熟時間的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0～0.5 d時，Caspase-3活力顯著升高（P＜0.05）；在0.5 d時其活力達到最大值；0.5 d后其活力迅速降低。同時，在0.5～3 d內(nèi)，實驗組Caspase-3活力極顯著高于對照組（P＜0.01）。本研究結(jié)果表明，Hsp27抑制劑處理后，藏羊肉中Caspase-3的活力顯著升高，可能由于Hsp27通過調(diào)節(jié)細胞色素c的釋放，能間接抑制Caspase-3的激活。此外，Voss等的研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可以與Caspase-3的部分區(qū)域相互作用，并抑制Caspase-3激活所必需的部分位點[14]。由圖1B可知，Caspase-9活力隨著成熟時間的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0～0.5 d時，Caspase-9活力顯著升高（P＜0.05）；在0.5 d時，其活力達到最大值；0.5 d后其活力緩慢降低。同時，在0.5～3 d內(nèi)，對照組Caspase-9活力極顯著低于實驗組（P＜0.01）。Kemp等在宰后豬肉背肌中檢測到了Caspase-3的原激活片段，并發(fā)現(xiàn)其活力約在宰后2 h達到最大值[21]；Samejima等研究發(fā)現(xiàn)，宰后豬肉在成熟過程中Caspase-3出現(xiàn)酶活力值高峰[22]；賈青研究發(fā)現(xiàn)，宰后12 h，牛背最長肌Caspase-3活力達到最高之后出現(xiàn)顯著下降[17]。以上研究結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3活力在0.5 d時達到最大值的結(jié)果基本一致。Huang Ming等研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3在肌肉蛋白降解中有積極作用[23]。本研究結(jié)果表明，Hsp27抑制劑能夠明顯抑制Caspase-3、Caspase-9活力，進而抑制肌原纖維蛋白降解，提示Hsp27能夠通過抑制蛋白質(zhì)降解從而達到維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。這與Ding Zhenjiang等[15]發(fā)現(xiàn)Hsp27重組蛋白能夠抑制Caspase-3活力及肌原纖維蛋白降解，以及郭有鋒等[24]發(fā)現(xiàn)熱耐受后Hsp27的聚集可顯著減輕缺血損害導(dǎo)致的細胞凋亡的結(jié)果一致。Rane研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可通過調(diào)控Caspase-9活力抑制細胞凋亡[25]，這也與本研究中Hsp27抑制劑促進Caspase-9活力的結(jié)果一致。

2.2 藏羊肉宰后成熟過程中MFI的變化

圖 2 Hsp27抑制劑對MFI的影響Fig. 2 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar fragmentation index

Huff-Lonergan等發(fā)現(xiàn)宰后肌原纖維蛋白降解與肌纖維小片化是成熟嫩化的重要因素[26]。由圖2可知，MFI隨著成熟時間的延長整體呈上升趨勢。0～0.5 d時MFI變化較小；0.5 d時，實驗組和對照組存在顯著差異（P＜0.05）；0.5 d后，實驗組和對照組差異極顯著（P＜0.01）。表明Hsp27抑制劑能夠促進成熟過程中蛋白的降解，促使MFI增加。同時，反映出Hsp27可以抑制肌原纖維小片化的發(fā)生。這與Noguchi等隨著細胞凋亡程度的加深，肌原纖維小片化程度加劇的研究結(jié)果基本一致[27]。

2.3 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白溶解性的變化

圖 3 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig. 3 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein solubility

由圖3可知，隨著成熟時間的延長肌原纖維蛋白溶解性增加。但在成熟0.5 d和1 d時，實驗組樣品的肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著；0 d和0.5 d時，對照組樣品肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著。實驗組樣品在成熟0.5 d后肌原纖維蛋白溶解性極顯著高于對照組（P＜0.01），這可能是由于Hsp27抑制劑促進了Caspase-3、Caspase-9的活力，進而加速了細胞凋亡，側(cè)面反映出Hsp27能夠維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，抑制細胞凋亡發(fā)生。

2.4 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白變化

圖 4 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白降解的影響Fig. 4 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein degradation

由圖4可知，隨著成熟時間的延長，肌原纖維蛋白中的肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T免疫印跡條帶明顯變淺，表明Hsp27抑制劑的添加促進了肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，提示Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。這與Ding Zhenjiang等[15]的研究結(jié)果一致；同時，也與Lomiwes等[10]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白能夠在外源αβ-晶狀體蛋白與μ-鈣激活酶作用下維持肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的結(jié)果基本一致。肌原纖維的降解在宏觀表現(xiàn)為肉嫩度改善、汁液增多、風(fēng)味改善等，Bernard等研究發(fā)現(xiàn)Hsp27在夏洛萊牛胸部肌肉中表達量的下調(diào)能夠改善肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味[28]。Balan等[29]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)Hsp27降解，且與肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解顯著相關(guān)，并推測降解后的Hsp27喪失了其對肌原纖維蛋白的保護功能，從而提高肌原纖維蛋白的水解，這與本實驗結(jié)果一致。

2.5 Hsp27對肌原纖維蛋白的體外降解

由圖5可知，2、4號樣品條帶明顯比1號樣品淡，表明Caspase-3和μ-鈣激活酶均能使肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白降解；比較2號樣品與3號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制Caspase-3對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；比較4號樣品與5號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；比較1號樣品與5號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠維持肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的穩(wěn)定性；比較1號樣品與7號樣品，發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠促進肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；與1號樣品比較，6號樣品條帶更寬、顏色更深，表明Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。綜上所述，Hsp27的添加抑制了Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解。這與Lomiwes等發(fā)現(xiàn)Hsp27在肉中表達量的下降有利于肌動蛋白與肌球蛋白的水解，進而導(dǎo)致肉嫩度增加，且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低的研究結(jié)果一致[10]。Morzel[11]和Ding Zhenjiang[15]等研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27可維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，抑制其降解，并且其表達量與牛肉的韌性呈負相關(guān)；Della等[30]研究表明，小分子熱休克蛋白可以保護肌鈣蛋白-T免受降解，其表達與嫩度呈負相關(guān)。這與本實驗研究中Hsp27抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解的結(jié)果一致。

圖 5 體外肌原纖維蛋白降解變化Fig. 5 In vitro changes in myofibrillar protein degradation

3 結(jié) 論

Hsp27能夠抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解；同時，Hsp27通過影響Caspase-3和Caspase-9的活力來參與宰后成熟過程。Hsp27能夠通過抑制Caspase-3和Caspase-9的活力來抑制肌原纖維小片化的發(fā)生以及肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，從而保持了肌原纖維的完整性，抑制了肌肉在宰后成熟過程中的嫩化。