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        藏羊肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27對肌原纖維蛋白及細胞凋亡酶的影響

        2020-03-01 21:27:26孫金龍師希雄岳建偉
        食品科學(xué) 2020年3期

        孫金龍,師希雄*,黃 峰,韓 玲,陳 騁,岳建偉

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

        藏羊是我國原始綿羊品種之一,分布廣泛,在家畜中所占比重較大[1]。歐拉藏羊是藏羊的主要品種之一,主要生長在甘肅、青海、西藏等青藏高原的高海拔地區(qū),特殊的生長環(huán)境造就了歐拉藏羊耐高寒、個體高大和生長較快速的特點[2]。并且歐拉藏羊肉味道鮮美、風(fēng)味獨特,具有良好的營養(yǎng)和食用品質(zhì)[3]。但粗放的飼養(yǎng)方式同時也導(dǎo)致歐拉藏羊肉的纖維較粗,使得其肉嫩度較差,嚴重制約了肉品加工領(lǐng)域?qū)W拉藏羊肉的開發(fā)和利用。因此,改善歐拉藏羊肉嫩度、提高其食用品質(zhì),對歐拉藏羊肉的生產(chǎn)加工具有重要意義。

        成熟是肌肉在宰后發(fā)生的重要生理性變化,在此過程中,肌肉的嫩度、色澤、保水性和風(fēng)味均會得到改善[4]。其中,成熟過程對肌肉嫩度的影響最大。國內(nèi)外研究報道指出,宰后成熟嫩化主要歸因于內(nèi)源性蛋白酶對肌原纖維蛋白的有限降解[5-7]。肉中肌原纖維蛋白的降解破壞了肌纖維結(jié)構(gòu),在很大程度上改善了肉的嫩度,進而提高了肌肉的食用品質(zhì)[8]。但是,目前肉的成熟嫩化機理尚未明確。動物屠宰后,缺血、缺氧的應(yīng)激狀態(tài)不僅打破了肌肉的生理平衡,同時也刺激了小分子熱休克蛋白的表達。熱休克蛋白27(heat shock protein 27,Hsp27)是小分子熱休克蛋白的一種,經(jīng)常被用于小分子熱休克蛋白對細胞凋亡的相關(guān)研究。

        至今,哺乳動物中鑒別出數(shù)十種小分子熱休克蛋白,它們普遍存在且在特殊組織內(nèi)表達[9]。Hsp20、Hsp27和αβ-結(jié)晶蛋白等小分子熱休克蛋白的表達水平均高于骨骼肌中其他蛋白質(zhì),被認為是心肌肌肉嫩化的潛在因素[10]。

        Morzel等報道Hsp27可維持肌原纖維的穩(wěn)定性,其表達量與牛肉的韌性呈負相關(guān)[11]。安格斯牛背最長肌中Hsp27表達量的下降有利于肌球蛋白和肌動蛋白的水解,進而提高了肌肉嫩度;且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低[12]。然而,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果中Hsp27和嫩度的關(guān)系并不一致。Contreras-Castillo等指出,肌原纖維結(jié)合的小分子熱休克蛋白可以作為μ-鈣激活酶替代基質(zhì),并導(dǎo)致了肉的嫩化[13]。Hsp27與Caspase-3氨基末端的肽相互作用,為細胞凋亡效應(yīng)酶提供了一種新的調(diào)控機制[14]。以上研究指出,Hsp27可能通過影響μ-鈣激活酶和Caspase-3在心肌成熟過程中降低肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性,但其具體機制仍需進一步探究。

        總之,Hsp27對肌原纖維蛋白和細胞凋亡酶的影響研究結(jié)果不一致。目前,關(guān)于歐拉藏羊肉宰后成熟過程中Hsp27的作用鮮有報道。因此,本實驗利用Hsp27的抑制劑(KRIBB3)對歐拉藏羊背最長肌進行處理,在相應(yīng)時間點取樣,并對肌原纖維蛋白的降解特性和細胞凋亡酶活力進行測定,探討Hsp27對肌原纖維蛋白降解及細胞凋亡酶活力的影響,以闡明Hsp27對羊肉的調(diào)控機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        3~4 歲的歐拉藏羊6 只,體質(zhì)量相近,生理成熟度等指標(biāo)基本相似,采自甘南安多畜牧有限公司。參考國內(nèi)外對動物福利的相關(guān)要求,屠宰方式嚴格按照國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)操作進行,宰前保證藏羊健康狀況良好,宰后熱應(yīng)激波動幅度較小,跟腱吊掛,從半胴體上取下整條背最長肌作為實驗材料。

        Caspase-3、Caspase-9酶活力試劑盒 北京麥瑞博生物科技有限公司;Hsp27抑制劑(KRIBB3)、Csapase-3重組蛋白、μ-鈣激活酶(活力6 000 U)英國Abcam公司;蛋白Marker、Hsp27標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白一抗、二抗 北京索萊寶科技有限公司;ECL發(fā)光試劑盒美國Thermo公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;FA2004B電子天平 上海佑科儀器有限公司;HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;iMark全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;XHF-D內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WH-600-LCD型電泳儀 北京市六一儀器廠;脫色搖床 海門其林貝爾儀器制造公司;凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司;-80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品的制備

        在屠宰后0.5 h內(nèi)取下背最長肌,剔除脂肪和結(jié)締組織膜,將0 d和體外模擬實驗的樣品切成5 g大小,用錫箔紙包裹迅速裝入液氮中運回實驗室,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。實驗組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋,按固液比1∶2注入提前準(zhǔn)備好的30 mmol/L KRIBB3溶液,4 ℃下快速運回實驗室并在4 ℃冰箱成熟,分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣,并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。對照組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋中,存放在干冰中快速運回實驗室轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱成熟,分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣,并測定Caspase-3、Caspase-9的活力以及免疫印跡等指標(biāo),待測樣品轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

        1.3.2 體外實驗

        參考Ding Zhenjiang等的方法,略有改動[15]。取提取純化后的肌原纖維蛋白(0.5 g)7 份,編號為1~7,以加入10 μg蒸餾水的1號樣作為空白對照,2號樣加入10 μg Caspase-3處理,3號樣加入10 μg Caspase-3和6 μg Hsp27處理,4號樣加入10 μg μ-鈣激活酶處理,5號樣加入10 μg μ-鈣激活酶和6 μg Hsp27處理,6號樣用6 μg Hsp27處理,7號樣用10 μL 0.01 mol/L鈣離子處理,1~7號樣均在30 ℃下孵育2 h。對肌原纖維蛋白特性進行免疫印跡分析。

        1.3.3 Caspase-3、Caspase-9活力測定

        參考孫志昶等測定細胞凋亡酶活力的方法[16]。采用試劑盒測定Caspase-3、Caspase-9活力。準(zhǔn)確稱取待測肉樣10 mg,加入150 μL裂解液,在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿30 次。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,冰浴5 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,把上清液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的離心管中,在冰中保存待用。分別取Caspase-3、Caspase-9的檢測緩沖液40 μL、待測樣品50 μL,適當(dāng)混勻后,分別加入Caspase-3、Caspase-9底物Ac-DEVD-pNA、Ac-LEHD-pNA 10 μL,混勻后,在37 ℃下孵育2 h。待顏色發(fā)生明顯變化后測定其A405nm,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算活力。

        1.3.4 MFI測定

        肌原纖維小片化指數(shù)(myofibrillar fragmentation index,MFI)測定參考賈青的方法并稍作改進[17]。準(zhǔn)確稱取待測肉樣1 g,放入離心管中,加入10 mL MFI緩沖液(100 mmol/L KCl、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、20 mmol/L K3PO4),用勻漿機100 000 r/min冰浴勻漿30 s,1 000hg離心15 min。棄去上清液,加入8 mL MFI緩沖液,100 000 r/min冰浴勻漿15 s,1 000hg離心15 min。棄去上清液,再加入10 mL MFI緩沖液,置于均質(zhì)機上振蕩,將上述溶液倒入200 目篩,過濾沉淀,利用雙縮脲法測定肌原纖維提取液內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度,再用MFI緩沖液調(diào)整肌原纖維提取液蛋白質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL,在540 nm波長處測定吸光度,每個樣品重復(fù)3 次。將平均值代入公式(1)計算MFI。

        1.3.5 肌原纖維蛋白提取及質(zhì)量濃度的測定

        肌原纖維蛋白的提取采用Xia Xiufang等的方法并加以改進[18]。準(zhǔn)確稱取1 g肉樣,加入10 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液(0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸,pH 6.80),13 000 r/min勻漿10 s,4 ℃、1 000hg離心10 min,棄上清液,沉淀用8 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液溶解后,4 ℃、1 000hg離心10 min,棄上清液,重復(fù)兩次。沉淀用8 倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后,4 ℃、1 000hg離心10 min,棄上清液,重復(fù)兩次。沉淀中加4 mL 25 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.25),用雙縮脈法測定肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度,用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.6 肌原纖維蛋白溶解性測定

        肌原纖維蛋白溶解性的測定參考Agyare等的方法并加以改進[19]。按1.3.5節(jié)方法提取肌原纖維蛋白并測定其質(zhì)量濃度。準(zhǔn)確稱取肌原纖維蛋白1 g,溶于50 mL質(zhì)量分數(shù)為0.75%的氯化鈉溶液中,用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 5.5,并在60 ℃水浴鍋中水浴加熱30 min,4 ℃、6 000 r/min離心15 min,取上清液,采用雙縮脲法測定離心前后上清液中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度,按式(2)計算肌原纖維蛋白溶解性。

        1.3.7 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和免疫印跡分析

        參考黃峰[20]的方法,聚丙烯酰胺變性凝膠電泳使用質(zhì)量分數(shù)4%濃縮膠,肌間線蛋白分離膠質(zhì)量分數(shù)為10%,肌鈣蛋白-T分離膠質(zhì)量分數(shù)為12.5%。采用濕法轉(zhuǎn)印將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到膜上,轉(zhuǎn)印液含有20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、體積分數(shù)15%甲醇溶液。轉(zhuǎn)印條件為恒流200 mA,時間90 min。轉(zhuǎn)印后的聚偏二佛乙烯膜膜用含質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液(500 mmol/L NaCl、質(zhì)量分數(shù)0.05% Tween 20、30 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5)室溫封閉1 h。與一抗在4 ℃下反應(yīng)過夜,然后用TBST溶液漂洗3 次,每次10 min,以去除未結(jié)合的一抗。然后把膜放入二抗中在室溫、避光條件下反應(yīng)60 min。在TBST溶液中漂洗3 次,每次10 min。使用ECL發(fā)光試劑盒在暗室中壓片、曝光。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        本實驗的材料均進行3 組平行處理,用Origin 8.5軟件繪制柱狀圖,并用SPSS Statistics 20.0軟件進行誤差分析,用Duncan’s法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 藏羊肉宰后成熟過程中Caspase-3、Caspase-9活力變化

        圖 1 Hsp27抑制劑對Caspase-3(A)、Caspase-9(B)活力的影響Fig. 1 Effect of Hsp27 inhibitor on caspase-3 (A) and caspase-9 (B) activity

        由圖1A可知,對照組中Caspase-3活力隨著成熟時間的延長,整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0~0.5 d時,Caspase-3活力顯著升高(P<0.05);在0.5 d時其活力達到最大值;0.5 d后其活力迅速降低。同時,在0.5~3 d內(nèi),實驗組Caspase-3活力極顯著高于對照組(P<0.01)。本研究結(jié)果表明,Hsp27抑制劑處理后,藏羊肉中Caspase-3的活力顯著升高,可能由于Hsp27通過調(diào)節(jié)細胞色素c的釋放,能間接抑制Caspase-3的激活。此外,Voss等的研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可以與Caspase-3的部分區(qū)域相互作用,并抑制Caspase-3激活所必需的部分位點[14]。由圖1B可知,Caspase-9活力隨著成熟時間的延長,整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0~0.5 d時,Caspase-9活力顯著升高(P<0.05);在0.5 d時,其活力達到最大值;0.5 d后其活力緩慢降低。同時,在0.5~3 d內(nèi),對照組Caspase-9活力極顯著低于實驗組(P<0.01)。Kemp等在宰后豬肉背肌中檢測到了Caspase-3的原激活片段,并發(fā)現(xiàn)其活力約在宰后2 h達到最大值[21];Samejima等研究發(fā)現(xiàn),宰后豬肉在成熟過程中Caspase-3出現(xiàn)酶活力值高峰[22];賈青研究發(fā)現(xiàn),宰后12 h,牛背最長肌Caspase-3活力達到最高之后出現(xiàn)顯著下降[17]。以上研究結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3活力在0.5 d時達到最大值的結(jié)果基本一致。Huang Ming等研究發(fā)現(xiàn),Caspase-3在肌肉蛋白降解中有積極作用[23]。本研究結(jié)果表明,Hsp27抑制劑能夠明顯抑制Caspase-3、Caspase-9活力,進而抑制肌原纖維蛋白降解,提示Hsp27能夠通過抑制蛋白質(zhì)降解從而達到維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。這與Ding Zhenjiang等[15]發(fā)現(xiàn)Hsp27重組蛋白能夠抑制Caspase-3活力及肌原纖維蛋白降解,以及郭有鋒等[24]發(fā)現(xiàn)熱耐受后Hsp27的聚集可顯著減輕缺血損害導(dǎo)致的細胞凋亡的結(jié)果一致。Rane研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可通過調(diào)控Caspase-9活力抑制細胞凋亡[25],這也與本研究中Hsp27抑制劑促進Caspase-9活力的結(jié)果一致。

        2.2 藏羊肉宰后成熟過程中MFI的變化

        圖 2 Hsp27抑制劑對MFI的影響Fig. 2 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar fragmentation index

        Huff-Lonergan等發(fā)現(xiàn)宰后肌原纖維蛋白降解與肌纖維小片化是成熟嫩化的重要因素[26]。由圖2可知,MFI隨著成熟時間的延長整體呈上升趨勢。0~0.5 d時MFI變化較小;0.5 d時,實驗組和對照組存在顯著差異(P<0.05);0.5 d后,實驗組和對照組差異極顯著(P<0.01)。表明Hsp27抑制劑能夠促進成熟過程中蛋白的降解,促使MFI增加。同時,反映出Hsp27可以抑制肌原纖維小片化的發(fā)生。這與Noguchi等隨著細胞凋亡程度的加深,肌原纖維小片化程度加劇的研究結(jié)果基本一致[27]。

        2.3 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白溶解性的變化

        圖 3 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig. 3 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein solubility

        由圖3可知,隨著成熟時間的延長肌原纖維蛋白溶解性增加。但在成熟0.5 d和1 d時,實驗組樣品的肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著;0 d和0.5 d時,對照組樣品肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著。實驗組樣品在成熟0.5 d后肌原纖維蛋白溶解性極顯著高于對照組(P<0.01),這可能是由于Hsp27抑制劑促進了Caspase-3、Caspase-9的活力,進而加速了細胞凋亡,側(cè)面反映出Hsp27能夠維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性,抑制細胞凋亡發(fā)生。

        2.4 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白變化

        圖 4 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白降解的影響Fig. 4 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein degradation

        由圖4可知,隨著成熟時間的延長,肌原纖維蛋白中的肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T免疫印跡條帶明顯變淺,表明Hsp27抑制劑的添加促進了肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解,提示Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。這與Ding Zhenjiang等[15]的研究結(jié)果一致;同時,也與Lomiwes等[10]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白能夠在外源αβ-晶狀體蛋白與μ-鈣激活酶作用下維持肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的結(jié)果基本一致。肌原纖維的降解在宏觀表現(xiàn)為肉嫩度改善、汁液增多、風(fēng)味改善等,Bernard等研究發(fā)現(xiàn)Hsp27在夏洛萊牛胸部肌肉中表達量的下調(diào)能夠改善肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味[28]。Balan等[29]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)Hsp27降解,且與肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解顯著相關(guān),并推測降解后的Hsp27喪失了其對肌原纖維蛋白的保護功能,從而提高肌原纖維蛋白的水解,這與本實驗結(jié)果一致。

        2.5 Hsp27對肌原纖維蛋白的體外降解

        由圖5可知,2、4號樣品條帶明顯比1號樣品淡,表明Caspase-3和μ-鈣激活酶均能使肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白降解;比較2號樣品與3號樣品,發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制Caspase-3對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解;比較4號樣品與5號樣品,發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解;比較1號樣品與5號樣品,發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠維持肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的穩(wěn)定性;比較1號樣品與7號樣品,發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠促進肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解;與1號樣品比較,6號樣品條帶更寬、顏色更深,表明Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。綜上所述,Hsp27的添加抑制了Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解。這與Lomiwes等發(fā)現(xiàn)Hsp27在肉中表達量的下降有利于肌動蛋白與肌球蛋白的水解,進而導(dǎo)致肉嫩度增加,且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低的研究結(jié)果一致[10]。Morzel[11]和Ding Zhenjiang[15]等研究發(fā)現(xiàn),Hsp27可維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性,抑制其降解,并且其表達量與牛肉的韌性呈負相關(guān);Della等[30]研究表明,小分子熱休克蛋白可以保護肌鈣蛋白-T免受降解,其表達與嫩度呈負相關(guān)。這與本實驗研究中Hsp27抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解的結(jié)果一致。

        圖 5 體外肌原纖維蛋白降解變化Fig. 5 In vitro changes in myofibrillar protein degradation

        3 結(jié) 論

        Hsp27能夠抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解;同時,Hsp27通過影響Caspase-3和Caspase-9的活力來參與宰后成熟過程。Hsp27能夠通過抑制Caspase-3和Caspase-9的活力來抑制肌原纖維小片化的發(fā)生以及肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解,從而保持了肌原纖維的完整性,抑制了肌肉在宰后成熟過程中的嫩化。

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