丁浩, 危志強(qiáng), 蔡小琴, 李海濤, 章旭, 曹娟

蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院腎內(nèi)科(江蘇泰興 225400)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)已成為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)及終末期腎功能衰竭(end stage renal disease，ESRD)患者的重要病因[1]。血管內(nèi)皮功能紊亂是DKD患者的常見并發(fā)癥，以大血管和微血管病變?yōu)樘卣鳎绊懚鄠€(gè)器官，導(dǎo)致DKD患者的心血管發(fā)病率和病死率升高[2]。冠心病(coronary heart disease，CHD)、腦血管意外(cerebrovascular accident，CVA)及外周動(dòng)脈閉塞性疾病(peripheral artery occlusive disease，PAOD)等大血管病變和視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變等微血管病變均可導(dǎo)致不良預(yù)后[1]。因此，對(duì)血管病變的早期干預(yù)、發(fā)現(xiàn)血管病變的早期生物標(biāo)志物，具有十分重要的意義。Klotho蛋白是由人類Klotho基因編碼的跨膜蛋白，主要在腎臟和大腦中表達(dá)，參與機(jī)體的衰老及對(duì)胰島素敏感性調(diào)控，在一氧化氮生成和高磷血癥的調(diào)控中起重要作用[3]。既往的研究表明，小鼠Klotho蛋白缺乏可導(dǎo)致多種疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、中風(fēng)、骨質(zhì)疏松癥、異位鈣化、皮膚萎縮、慢性血管疾病、壽命縮短以及不育[3-5]。最近的研究表明，高水平的Klotho蛋白可降低代謝綜合征、腎臟疾病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。然而， Klotho蛋白與DKD患者血管病變的相關(guān)性尚不清楚，因此，本研究通過檢測(cè)DKD患者血清Klotho蛋白水平，探討血清Klotho蛋白水平與血管病變的相關(guān)性，為減少DKD患者心血管事件提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取2013年1月至2014年6月間在我院腎內(nèi)科住院，臨床診斷為DKD的患者，共124例，跟蹤隨訪5年,在隨訪期間，由于死亡(10例)或失訪(6例)，共108例患者成功完成本研究。其中，男64例，女44例，年齡(56.2±10.1)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18周歲或>70周歲；(2)血壓控制欠佳、妊娠、肝硬化的患者；(3)入組前近3個(gè)月內(nèi)有感染；(4)其他嚴(yán)重疾?。喝鐞盒阅[瘤、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、精神疾病等。

1.2 研究方法

1.2.1 收集入組患者的臨床資料 收集患者年齡、性別、身高、體重、糖尿病史、高血壓病史、吸煙史、既往血管病變史、收縮壓、舒張壓、用藥情況等。跟蹤隨訪5年，記錄每年相關(guān)臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查及血管病變?cè)u(píng)估結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 收集空腹靜脈血及中段晨尿標(biāo)本， 檢測(cè)血紅蛋白(Hb)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血糖(BG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、胰島素、C肽、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及尿蛋白/肌酐比值(UACR)，并計(jì)算腎小球?yàn)V過率(eGFR)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清Klotho蛋白水平，根據(jù)Klotho蛋白數(shù)值將所有患者分為低Klotho蛋白組和高Klotho蛋白組。

1.3 血管病變?cè)u(píng)估 大血管病變以動(dòng)脈粥樣硬化為主要表現(xiàn)，主要侵犯冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、肢體動(dòng)脈等，引起冠心病、腦血管病、肢體動(dòng)脈硬化等疾病，本研究中以CHD、CVA、PAOD作為大血管病變進(jìn)行評(píng)估；微血管病變的典型改變是微循環(huán)障礙和微血管基底膜增厚，主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜、腎、神經(jīng)等組織，本研究中以視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變作為微血管病變進(jìn)行評(píng)估。

1.4 相關(guān)定義及診斷

1.4.1 CHD 有臨床表現(xiàn)和心電圖檢查或?qū)嶒?yàn)室檢查確診的心肌梗死、典型心絞痛和(或)冠狀血管造影證實(shí)的冠狀動(dòng)脈疾病、曾接受經(jīng)冠狀動(dòng)脈血管旁路移植術(shù)或經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)引起的急性冠脈綜合征[8]。

1.4.2 CVA 根據(jù)臨床癥狀或頭顱CT、MRI等證實(shí)的缺血性或出血性腦血管疾患和短暫性局部腦缺血發(fā)作[9]。

1.4.3 PAOD 周圍動(dòng)脈硬化導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄，甚至發(fā)生閉塞，使遠(yuǎn)端組織出現(xiàn)相應(yīng)缺血痙攣或壞死，臨床表現(xiàn)為間歇性跛行、靜息痛及壞疽等，本研究采用多普勒超聲測(cè)量并計(jì)算踝臂指數(shù)(ABI)評(píng)估PAOD，ABI=足背或脛后動(dòng)脈收縮壓高者/最高肱動(dòng)脈收縮壓， PAOD被定義為ABI≤0.9或>1.3[10]。

1.4.4 視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)病變?cè)\斷 根據(jù)眼底檢查的結(jié)果診斷視網(wǎng)膜病變[11]。根據(jù)神經(jīng)測(cè)試的結(jié)果診斷出神經(jīng)病變，包括針刺痛覺、溫度覺、音叉振動(dòng)覺、10-g單絲壓力覺及踝反射[12]。

上述多普勒超聲、眼底檢查和神經(jīng)測(cè)試至少每年進(jìn)行1次，以評(píng)估PAOD、視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)病變；當(dāng)有臨床表現(xiàn)或依據(jù)時(shí)，進(jìn)行CHD和CVA的相關(guān)檢查。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基線臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 根據(jù)血清Klotho蛋白中位數(shù)(610 pg/mL)將入組患者分為兩組。高Klotho蛋白組患者的年齡、糖尿病史、視網(wǎng)膜病變比例、神經(jīng)病變比例、TC、HDL-C、LDL-C、BUN、UACR、他汀類藥物使用率顯著高于低Klotho蛋白組患者，而男性比例、吸煙比例顯著低于低Klotho蛋白組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表1。

項(xiàng)目所有入組患者(n=108)低Klotho蛋白組(n=54)高Klotho蛋白組(n=54)年齡(歲)56.2±10.152.4±10.660.0±9.5??男性[例(%)]64(59.3)38(70.4) 26(48.1)?糖尿病史[M(P25,P75)月] 67.0(37.0,85.0) 55.0(39.0,75.0) 86.5(66.5,111.0)??高血壓史[例(%)]40(37.0)19(35.2) 21(38.9) 吸煙史[例(%)]30(27.8)23(42.6) 7(13.0)??CHD史[例(%)]10(9.26)7(13.0)3(5.56)CVA史[例(%)]16(14.8)7(13.0)9(16.7)PAOD史[例(%)]11(10.2)5(9.3) 6(11.1)視網(wǎng)膜病變史[例(%)]23(21.3)7(13.0)16(29.6)?神經(jīng)病變史[例(%)]17(15.7)4(7.4) 13(24.1)?平均動(dòng)脈壓(mmHg)92.8±7.8 94.2±8.5 91.3±7.2 體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)27.0±4.427.6±4.626.4±4.1Hb(g/L)131.3±18.8126.7±22.3135.9±15.6TC(mmol/L)4.58±0.364.33±0.20 4.85±0.28??TG(mmol/L)1.72±0.141.87±0.161.56±0.13HDL-C(mmol/L)1.04±0.110.91±0.101.18±0.12??LDL-C(mmol/L)2.62±0.162.50±0.182.82±0.11?BUN[M(P25,P75)mmol/L]11.1(8.7,14.1)10.1(7.1,12.7)12.4(9.9,15.5)?Scr[M(P25,P75)μmol/L]148(108,193)151(111,199)130(91,176)eGFR[mL/(min/1.73m2)]52.9±22.749.0±21.656.9±23.7UACR[M(P25,P75)mg/mmol]33.3(20.3,50.2)30.2(24.6,36.2)36.5(14.5,62.8)?BG(mmol/L)8.47±3.0 8.35±2.398.59±3.59HbA1C(%)7.6±1.67.6±1.67.7±1.7胰島素[M(P25,P75)μIU/mL]9.1(5.4,13.0)10.3(6.3,15.3)8.0(5.1,11.2)C肽(ng/mL)3.2±2.03.3±2.13.0±1.9HOMA-IR3.2(1.8,4.7)3.6(1.8,5.2)2.7(1.7,3.9)hs-CRP[M(P25,P75)mg/L]2.6(0.4,5.0)3.0(0.4,5.3)2.0(0.3,4.4)ACEI[例(%)]8(7.4)4(7.4)4(7.4)ARB[例(%)]55(50.9)26(48.1)29(53.7)他汀類[例(%)]60(55.6)24(44.4)36(66.7)?

注：與低Klotho蛋白組比較 *P<0.05， **P<0.01

2.2 隨訪結(jié)果 在5年的隨訪期間，分別有10、13、5、5、29例患者出現(xiàn)CHD、CVA、PAOD、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變的新發(fā)或病變進(jìn)展。低Klotho蛋白組患者CHD、CVA的發(fā)生率顯著高于高Klotho蛋白組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),見表2。低Klotho蛋白組患者的大血管病變發(fā)生率及1個(gè)靶器官損害發(fā)生率也顯著高于高Klotho蛋白組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

2.3 基線Klotho蛋白水平與血管病變的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析顯示，Klotho蛋白水平與CHD(r=-0.232，P<0.01)和CVA(r=-0.223，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，與PAOD、視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)病變無相關(guān)性。見表4。

2.4 大血管病變的危險(xiǎn)因素分析 單變量分析顯示，低Klotho蛋白水平是發(fā)生大血管病變、CHD、CVA和PAOD的危險(xiǎn)因素(表5)。進(jìn)一步的多變量logistic回歸分析顯示，Klotho蛋白水平是大血管病變、CHD和CVA的預(yù)測(cè)因子(表6)。

表2 5年隨訪期間血管病變的發(fā)生情況 例(%)

注：與低Klotho蛋白組比較*P<0.05，**P<0.01

表3 靶器官損害情況 例(%)

注：與低Klotho蛋白組比較 *P<0.01

3 討論

Klotho蛋白是一種單次跨膜蛋白，在腎臟中高表達(dá)，循環(huán)中的Klotho蛋白可以通過KlothomRNA選擇性剪接后表達(dá)或膜型Klotho蛋白水解直接產(chǎn)生[13]。膜型Klotho蛋白可作為FGF23的共同受體發(fā)揮作用，而循環(huán)中的Klotho蛋白作為一種激素因子，在抗氧化、離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)等過程中起重要作用[13-14]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白在2型糖尿病和DKD的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。Klotho蛋白能顯著增加胰腺β細(xì)胞數(shù)量、胰島素儲(chǔ)存和分泌水平，顯著增加糖尿病小鼠模型的血清胰島素水平，從而發(fā)揮有益作用[15]。此外，小鼠β細(xì)胞特異性表達(dá) Klotho蛋白可增加胰腺胰島十二指腸同源盒1、增殖細(xì)胞核抗原和微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3的表達(dá)[15]。這些結(jié)果表明Klotho蛋白在β細(xì)胞的特異性表達(dá)可改善β細(xì)胞功能并減緩2型糖尿病和DKD的進(jìn)展。

表4 Klotho蛋白水平與血管病變的相關(guān)性 r值

注：*P<0.01

表5 發(fā)生大血管病變的單變量危險(xiǎn)因素分析

注：*P<0.05，**P<0.01

表6 發(fā)生大血管病變的多變量危險(xiǎn)因素分析

注：模型1：未校正；模型2：校正年齡、性別；模型3：校正年齡、性別、高血壓史、吸煙史、LDL、HDL、eGFR、使用他汀類藥物；模型4：全校正。*P<0.05，**P<0.01

本研究發(fā)現(xiàn)，血清Klotho蛋白水平與CHD和CVA的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，這提示Klotho蛋白對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，與既往的一些研究[6, 16]結(jié)果相一致。Klotho蛋白可通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，調(diào)控一氧化氮的產(chǎn)生和鈣磷代謝，調(diào)節(jié)血管張力[17]。許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵诧@示Klotho蛋白可減少氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善內(nèi)皮功能紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化[18-19]。低Klotho蛋白水平與CHD、左心室肥厚、血壓控制欠佳、血管鈣化和壽命縮短密切相關(guān)[20]。

然而，對(duì)Klotho蛋白在2型糖尿病和DKD患者血管病變中的作用，相關(guān)的研究[20-22]結(jié)果卻不一致。van Ark等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不論2型糖尿病患者是否合并DKD，血清Klotho蛋白水平與大血管病變間無明顯相關(guān)性；而Keles等[20]研究發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白有助于預(yù)防1型糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化；有學(xué)者[22]研究發(fā)現(xiàn)血清Klotho蛋白水平的下降與微炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。本研究顯示血清Klotho蛋白水平下降會(huì)增加DKD患者的大血管病變的風(fēng)險(xiǎn)，低Klotho蛋白水平是DKD患者發(fā)生大血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究結(jié)果的不一致可能與患者的入組標(biāo)準(zhǔn)不同、病例數(shù)有限、Klotho蛋白檢測(cè)方法不同相關(guān)。大血管病變的核心機(jī)制是動(dòng)脈粥樣硬化，其機(jī)制涉及自由基形成和活性氧產(chǎn)生增加，而且DKD患者的長(zhǎng)期高血糖也可刺激動(dòng)脈粥樣硬化形成[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)低Klotho蛋白的患者也有較高的CVA發(fā)生率。Klotho基因主要在腎臟和大腦中表達(dá)[24]。既往研究發(fā)現(xiàn)Klotho-/-小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中，出現(xiàn)氧化應(yīng)激水平的增加和鈣代謝紊亂[14, 25]。最近的研究也表明Klotho蛋白可能也參與神經(jīng)元的變性過程，最終可導(dǎo)致CVA或認(rèn)知障礙[26-27]。另外，Klotho蛋白的基因多態(tài)性與心源性栓塞引起的缺血性卒中之間也存在相關(guān)性[20]。因此，上述研究結(jié)果可以解釋低Klotho蛋白水平與CVA之間的密切相關(guān)性。

此外，在研究開始時(shí)，高Klotho蛋白組患者微血管病變的發(fā)生率較高，這可能是因?yàn)楸狙芯咳虢M患者年齡較大、糖尿病病程較長(zhǎng)。而且經(jīng)過5年隨訪，兩組患者的微血管病變發(fā)生率也相似。研究表明，Klotho蛋白可減少氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能，并在細(xì)胞水平表現(xiàn)出保護(hù)血管的作用[28]。

由于血管病變可進(jìn)一步導(dǎo)致DKD患者的心血管疾病發(fā)病率和病死率升高，因此預(yù)防或早期治療十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)DKD患者血清Klotho蛋白與血管病變的相關(guān)性，仍需要長(zhǎng)期縱向研究，以便更好地理解血清Klotho蛋白水平與血管病變之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性。早期發(fā)現(xiàn)低Klotho蛋白血癥、并及時(shí)干預(yù)治療，是預(yù)防DKD患者血管病變的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究是單中心、小樣本研究，這限制了研究結(jié)果的普適性，需要多中心、大樣本研究來進(jìn)一步明確。其次，既往的研究表明，F(xiàn)GF23與Klotho蛋白可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生協(xié)同作用，加速心血管疾病的進(jìn)展，包括CHD、左心室肥厚和血管內(nèi)皮功能紊亂，與Klotho蛋白相反，F(xiàn)GF23在血管病變中的作用已在許多臨床研究中得到證實(shí)[29]。然而，本研究未檢測(cè)FGF23水平，因此無法確定Klotho蛋白的作用是依賴于FGF23還是獨(dú)立于FGF23，需要后續(xù)研究探討FGF23在其中的作用。第三，既往的研究表明，使用他汀類藥物和RAAS抑制劑可能會(huì)影響Klotho蛋白的作用[5]，因此，本研究中他汀類藥物和RAAS抑制劑的高使用率也可能會(huì)影響研究結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DKD患者低Klotho蛋白水平與大血管病變之間存在相關(guān)性，是大血管病變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。仍需要進(jìn)一步的臨床研究，驗(yàn)證其潛在的治療價(jià)值。