馮耀培，宋娟，鄭斯文，曲正義，姚麗娜，王英平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

病毒性肝炎發(fā)病率在當(dāng)今社會日趨增加，逐漸成為影響人們生活的元兇。CCl4肝損傷模型作為經(jīng)典模型，研究較為廣泛。CCl4進入機體后，在肝細(xì)胞色素P450 影響下，被代謝產(chǎn)生氯仿自由基（CCl3·），引起肝組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，并對細(xì)胞膜和細(xì)胞器造成損傷[1]，其損傷特點與人類病毒性肝炎類似[2-3]。因此，建立CCl4肝損傷模型，開展對CCl4肝損傷保護作用研究具有重要意義。

云芝，多孔菌科真菌彩絨革蓋菌〔Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel〕的干燥子實體，是一種常用中藥，收錄于《中國藥典》一部2015年版[4]，具有明顯的消炎保肝、抗氧化等生物活性[5-7]，因此，云芝成為當(dāng)下研究的熱點。已有研究人員開展云芝多糖對免疫性、酒精性和乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷的保護作用研究[8-10]，取得較好療效。本實驗室前期開展云芝提取物對酒精肝損傷保護作用研究，初步得出CVE能緩解酒精造成的小鼠肝臟損傷，具有較好治療效果。因此，基于CVE對酒精肝損傷具有良好保護作用，分別從肝臟病理、肝臟功能以及脂質(zhì)過氧化等方面進行試驗，開展CVE對小鼠 CCl4肝損傷的保護作用研究，并探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

ICR 小鼠，雄性，18.0～22.0 g，6 月齡。購于長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（吉）-2015-0001。

1.2 材料

云芝材料采自吉林省延邊州汪清縣林區(qū)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)宋慧教授鑒定為多孔菌科彩絨革蓋菌（C.versicolor Quel）的干燥子實體。

云芝浸膏（Coriolus versicolor extract,CVE）由本實驗室提取完成，提取過程為將700.0 g 云芝清洗干凈，加入12 倍量的蒸餾水，蒸煮3.0 h；第2 次再加入10 倍量蒸餾水，繼續(xù)蒸煮3.0 h。所得浸膏即為試驗所需藥物，試驗時，用生理鹽水將其稀釋為所需濃度。

1.3 試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號：20180622）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號：20180622）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號：20180622）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號：20180622）、總膽固醇（TC）試劑盒（批號：20180622）、低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒（批號：20180622）、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒（批號：20180622）、小鼠血清腫瘤壞死因子-酶聯(lián)免疫（TNF-）試劑盒（批號：S20180819CW）、小鼠血清白介素-6酶聯(lián)免疫（IL-6）試劑盒（批號：S20180819CW）、小鼠血清白介素-1 酶聯(lián)免疫（IL-1 ）試劑盒（批號：S20180819CW）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20180622）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20180622）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：20180622）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號：20180622），以上試劑均購于南京建成生物工程研究所；H ＆ E 染色試劑盒（批號：20170612，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；生理鹽水（遼寧民康制藥有限公司）；水飛薊素（陜西森弗天然制品有限公司）；魯花花生油（山東魯花集團公司）；無水乙醇、甲醛、二甲苯、四氯化碳等均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

TGL-16 K 型離心機（湖南湘儀離心機廠）；HH-4型恒溫水浴鍋（常州澳華儀器公司）；FA 1004 B 型電子天平、YP 5002 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；BioTek-Epoch 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；SK 5200 H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；LEICA EG 1150 H 型包埋機、LEICA RM 2255 型切片機（德國徠卡公司）；KD-T 型攤片機（浙江省科迪儀器設(shè)備有限公司）；Coyote-Bio G 200 型組織勻漿破碎儀（卡尤迪生物科技）；OLYMPUS BX 53 型光學(xué)顯微鏡〔奧林巴斯（中國）有限公司〕。

2 方法

2.1 分組

將試驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d，隨機分6組，每組10只。分別為陰性對照組、模型組、水飛薊素組（50.0mg/kg）及CVE 低（50.0 mg/kg）、中（100.0 mg/kg）、高（300.0 mg/kg）劑量組。

2.2 試驗設(shè)計

保持動物飼養(yǎng)室溫度為25±2 ℃，自由飲食。隔日稱重，根據(jù)體重調(diào)整給藥量，劑量為10 mL/（kg·d），周期30 d，末次給藥后，禁食不禁水16 h。陰性對照組灌胃花生油，其余各組均灌胃1% CCl4花生油溶液建立肝損傷模型，劑量為5 mL/kg[11]，2 h 后解剖。摘眼球取血待測血清相關(guān)指標(biāo)；脫頸處死，取肝左葉，固定，待做病理學(xué)研究，取肝右葉置于液氮內(nèi)，待測肝組織相關(guān)指標(biāo)。

2.3 指標(biāo)測定

2.3.1 血清指標(biāo)檢測 摘眼球取血，4 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h，后于冷凍離心機內(nèi)，4 ℃，3 500 r/min 離心 10 min。取上清，以相同條件再次離心，分裝，置于 80 ℃冰箱內(nèi)待測血清 ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C、HDLC、TNF-、IL-6 和IL-1等生理生化指標(biāo)。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.3.2 肝組織病理切片檢查 取固定后的肝組織，切成規(guī)則方形小塊（0.75 1.00 0.75 cm），置于包埋盒內(nèi)。流水沖洗、脫水、浸蠟和包埋等步驟。切3m 厚度切片，攤片、烤片、H ＆ E 染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化，并拍照。

2.3.3 肝組織勻漿指標(biāo)檢測 取保存于液氮內(nèi)的肝組織樣本，用生理鹽水制作10%濃度勻漿，4℃，2500r/min離心10 min，取上清用于檢測蛋白質(zhì)含量、MDA、SOD、CAT 和GSH-Px 等相關(guān)指標(biāo)。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠肝組織病理變化

圖1 小鼠肝臟病理形態(tài)Fig.1 Liver pathomorphology in mice

由圖1 H ＆ E 染色結(jié)果顯示，陰性對照組肝細(xì)胞，圓潤飽滿、清晰可見，且細(xì)胞核呈規(guī)則圓形、胞質(zhì)豐富，胞漿未見細(xì)胞破碎、壞死及炎性浸潤等現(xiàn)象（圖1A）。模型組小鼠肝組織細(xì)胞損傷嚴(yán)重，中央靜脈周圍可見大量細(xì)胞碎片狀壞死及脂肪變性（圖1B），表明CCl4肝損傷模型造模成功。陽性對照組小鼠肝組織細(xì)胞出現(xiàn)碎片狀壞死及脂肪變性，但損傷程度得到明顯的改善（圖1C），顯著低于模型組。CVE 各給藥組小鼠肝組織細(xì)胞均出現(xiàn)碎片狀壞死及脂肪變性現(xiàn)象（圖1D、E、F），但損傷程度均低于模型組。結(jié)果表明，CVE 可以改善CCl4造成的肝臟脂肪變性及細(xì)胞碎片狀壞死，且高劑量組效果最佳。

3.2 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶相關(guān)指標(biāo)

由表1 可得，與陰性對照組相比，模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST活力均顯著性升高（P＜0.05）；相較于模型組，CVE 各給藥組均顯著降低ALT、AST 活力（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時高劑量組效果強于陽性對照組。

表1 小鼠血清AST、ALT 活力Table 1 Serum AST and ALT activities in mice （±s,n=10）

表1 小鼠血清AST、ALT 活力Table 1 Serum AST and ALT activities in mice （±s,n=10）

注：與陰性對照組比：#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與模型組對比：*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。下表同。Note:Compared with the normal group: #P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01;Compared with the model group: *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01.The follwing table is the same.

組別 Groups劑量〔mg/（kg·d）〕 Dosage ALT 活力（U/L） levels of ALTAST 活力（U/L） levels of AST陰性對照組 Negative control group 50.11±29.59 47.44±13.99模型組 Model group 290.53±1.02## 215.25±22.00##陽性對照組 Positive control group 50 284.21±4.83** 194.14±15.43*CVE 低劑量組 CVE low-dose group 50 283.70±4.85** 181.74±14.09**CVE 中劑量組 CVE middle-dose group 100 279.12±2.00** 166.25±24.4**CVE 高劑量組 CVE high-dose group 300 277.60±7.14** 180.45±15.62**

3.3 小鼠血清脂肪相關(guān)指標(biāo)

由表2 可得，與陰性對照組相比，模型組小鼠血清TBIL、TG、TC、LDL-C 含量顯著升高，且HDL-C 含量顯著降低（P ＜0.05）。陽性對照組TBIL、TG、TC、LDL-C 含量均低于模型組，且TBIL、TC 的含量顯著降低（P ＜ 0.05），HDL-C 含量顯著升高（P ＜ 0.05）。CVE各濃度組TBIL、TG、TC、LDL-C含量與模型組相比，顯著降低（P ＜ 0.05）；HDL-C 含量升高，但僅有高劑量組HDL-C 含量的顯著增高（P ＜0.05）?？傮w而言，小鼠血清各項指標(biāo)CVE 高劑量組效果最佳。

表2 小鼠血清 TBIL、TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量Table 2 Serum TBIL,TG,TC,LDL-C and HDL-C content in mice （±s,n=10）

表2 小鼠血清 TBIL、TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量Table 2 Serum TBIL,TG,TC,LDL-C and HDL-C content in mice （±s,n=10）

組別Groups劑量〔mg/（kg·d）〕Dosage TBIL（ mol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）陰性對照組 Negative control group 1.11±0.68 2.44±0.46 4.60±0.44 0.45±0.11 2.44±1.07模型組 Model group 10.50±2.59## 3.05±0.72# 7.15±0.68## 0.80±0.14## 1.48±0.54#陽性對照組 Positive control group 50 5.64±1.57** 2.56±0.30 4.17±0.96** 0.65±0.17 1.94±0.24*CVE 低劑量組 CVE low-dose group 50 6.49±2.17** 1.83±0.39** 3.78±0.57** 0.38±0.05** 1.67±0.61 CVE 中劑量組 CVE middle-dose group 100 7.34±1.71* 1.51±0.34** 3.44±0.96** 0.36±0.13** 1.88±0.53 CVE 高劑量組 CVE high-dose group 300 4.96±2.18** 1.29±0.30** 2.85±0.78** 0.33±0.11** 2.05±0.25*

3.4 小鼠血清炎性因子相關(guān)指標(biāo)

表3 小鼠血清 TNF- 、IL-6、IL-1 含量Table 3 Serum TNF- ,IL-6 and IL-1 content in mice （±s,n=10）

表3 小鼠血清 TNF- 、IL-6、IL-1 含量Table 3 Serum TNF- ,IL-6 and IL-1 content in mice （±s,n=10）

組別 Groups劑量〔mg/（kg·d）〕 DosageTNF-（ng/L）IL-6（ng/L）IL-1（ng/L）陰性對照組 Negative control group 112.67±12.47 27.85±8.32 21.38±4.58模型組 Model group176.67±49.66## 45.32±12.01## 49.26±9.84##陽性對照組 Positive control group 50 155.82±18.35 36.55±8.93 33.29±7.80**CVE 低劑量組 CVE low-dose group 50 169.25±27.81 39.04±10.14 38.36±6.78*CVE 中劑量組 CVE middle-dose group 100 172.61±19.17 33.53±9.20* 37.44±6.25*CVE 高劑量組 CVE high-dose group 300 130.58±31.98* 28.37±11.15** 29.06±4.29**

3.5 小鼠肝組織氧化還原相關(guān)指標(biāo)

由表4 可得，與陰性對照組相比，模型組小鼠肝組織 SOD、CAT 及 GSH-Px 活力降低，除 GSH-Px 活力外其余差異均顯著（P＜0.05）；MDA含量顯著升高（P＜0.01）。陽性對照組SOD、GSH-Px 及CAT 活力均高于模型組，除GSH-Px 活力外其余差異均顯著（P ＜0.05）；MDA 含量低于模型組。CVE 各組 SOD、CAT及 GSH-Px 活力均高于模型組（P ＜ 0.01）；MDA 含量均低于模型組，且高劑量組各項指標(biāo)均差異顯著（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，小鼠肝組織勻漿各項指標(biāo)CVE高劑量組效果最佳。

表4 小鼠肝組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量Table 4 The levels of SOD,CAT,GSH-Px activities and MDA content in liver tissues in mice （±s,n=10）

表4 小鼠肝組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量Table 4 The levels of SOD,CAT,GSH-Px activities and MDA content in liver tissues in mice （±s,n=10）

組別 Groups劑量〔mg/（kg·d）〕Dosage SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）CAT（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）陰性對照組 Negative control group 40.15±1.01 4.60±2.13 161.33±86.95 9.60±5.86模型組 Model group 30.11±3.02## 3.30±0.66 84.14±42.12# 19.51±5.57##陽性對照組 Positive control group 50 40.14±2.02* 3.88±1.84 137.50±54.15* 15.89±3.96 CVE 低劑量組 CVE low-dose group 50 45.17±4.13** 3.79±0.34* 100.63±17.47 13.57±9.80 CVE 中劑量組 CVE middle-dose group 100 46.13±3.02** 3.53±0.54 103.57±57.84 13.46±6.71*CVE 高劑量組 CVE high-dose group 300 48.16±4.01** 4.24±0.99* 139.58±35.36** 13.35±1.80**

4 討論與結(jié)論

通過觀察肝組織病理切片可得模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)大量溶解、脫落現(xiàn)象，而研究結(jié)果表明，CVE 能改善CCl4造成的肝細(xì)胞脫落、溶解，以及脂肪變性，這與孫卉等[12]開展的云芝多糖保肝效果所得結(jié)論一致。在前期開展云芝提取物對小鼠酒精肝損傷的保護作用研究中發(fā)現(xiàn)CVE能明顯改善肝功能及病理病變，這與本研究結(jié)果一致。

血清ALT和AST活性是評估肝損傷最常用指標(biāo)。在體內(nèi)，肝細(xì)胞內(nèi)的ALT 和AST 活力遠遠大于血液。在正常狀態(tài)下，肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶會通過較高的濃度差進入到血液中去[13]。而當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微的損傷時，細(xì)胞出現(xiàn)裂解，大量的ALT 和AST 等轉(zhuǎn)氨酶就會游離出來，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外及血清中轉(zhuǎn)氨酶活力急劇增大，血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高程度可反映出肝細(xì)胞的受損程度[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)CVE 對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT 和AST 活力升高具有良好的抑制作用。這與沈欽海等[17]開展的云芝保肝作用研究結(jié)論一致。且高劑量組效果最佳，強于水飛薊素。

機體肝臟受損時，體內(nèi)會產(chǎn)生較多自由基，當(dāng)自由基含量超過人體承受范圍時，就會引起“氧中毒”，TBIL、TG、TC和LDL-C等含量會發(fā)生過度積累，進而導(dǎo)致血脂代謝發(fā)生紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體內(nèi)TG 含量升高時，常常伴隨著HDL-C 的降低，從而降低運輸膽固醇到肝臟中的能力，導(dǎo)致肝臟損傷[18]。TG 在肝細(xì)胞內(nèi)大量積累，進而造成脂肪病變，迫使肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)閮χ鞴伲罱K導(dǎo)致脂肪肝形成[19-20]。本研究測得CVE 可顯著降低小鼠血清內(nèi)積累的TBIL、TG、TC 和LDL-C 含量，并可使HDL-C 含量升高，且高劑量組效果最佳。

已有研究證明，肝病患者具有較高的促炎細(xì)胞因子[21]。TNF-、IL-1和IL-6 等誘導(dǎo)枯否氏細(xì)胞分泌和外周血單核細(xì)胞分泌，是重要的炎癥因子指標(biāo)[22]。在本研究中，CCl4肝損傷小鼠血清中TNF-、IL-1和IL-6 水平明顯增加，這表明CCl4引發(fā)促炎細(xì)胞因子釋放，而預(yù)給藥CVE 可以有效降低肝炎癥因子濃度。這與劉穎[23]開展蒸制桔梗對酒精肝損傷的保護作用結(jié)果一致。

機體存在SOD、CAT、GSH-Px 等組成的酶反應(yīng)體系，可有效清除機體產(chǎn)生的自由基。當(dāng)自由基的產(chǎn)生超過自身防御系統(tǒng)的清除能力時，就會發(fā)生氧化損傷，最直接傷害部位為肝臟[24]。當(dāng)機體發(fā)生脂質(zhì)過氧化時，會產(chǎn)生MDA。MDA 不僅能夠反應(yīng)肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的強弱，還可間接反應(yīng)自由基對肝細(xì)胞的損傷程度[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)CVE 能明顯升高SOD、CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶活力，并且降低肝組織中MDA 含量，從而達到對肝臟的保護作用。這與孫設(shè)宗、Ravan等[26-28]研究結(jié)果一致。試驗結(jié)果顯示，高劑量組效果最佳。

綜上所述，CVE 高劑量組保肝效果最佳，且強于水飛薊素。其保肝機制可能與抑制氧化應(yīng)激、改善相關(guān)酶類及細(xì)胞因子有關(guān)，這對云芝的臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)。