杜斌，劉學(xué)賢，郭湘，薛驥軒，范瑞文

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

哺乳動物毛發(fā)的顏色以及纖維直徑和長度，是纖維生產(chǎn)動物經(jīng)濟(jì)價值最重要的影響因素。毛色基因也有助于對農(nóng)場動物毛色的鑒定[1]。毛發(fā)的纖維直徑、長度和顏色由遺傳學(xué)和環(huán)境決定[2-4]。毛發(fā)和皮膚的顏色依賴于上皮基底部黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素[5]。哺乳動物黑素細(xì)胞能產(chǎn)生2種不同類型的黑色素，即真黑素（黑/棕色）和褐黑素（黃/紅棕色），真黑素與褐黑色素的質(zhì)量和比例決定了毛發(fā)和皮膚的最終顏色[6]。在嚙齒類動物中，毛發(fā)和皮膚的顏色涉及到很多基因的共同作用。色素沉著是生物體一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，目前人們?nèi)耘f還在探索miRNA對哺乳動物毛色調(diào)控的具體機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以調(diào)控黑色素合成過程中的主效基因并影響黑色素的生成。例如，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrosinase related protein 1，TYRP1）是直接影響黑色素合成的催化酶之一，也是miR-146a的靶基因之一，miR-146a通過抑制TYRP1的表達(dá)，從而直接影響酪氨酸向黑色素的轉(zhuǎn)化，造成黑色素合成的產(chǎn)量顯著減少[7]。小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）是黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關(guān) 蛋白2（Tyrosinase related protein 2，TYRP2）和TYRP1的直接上游基因，在皮膚顏色和黑素瘤中起著重要作用[8]，MITF也是黑色素經(jīng)典路徑MAPK路徑的下游重要調(diào)控因子。激活的MAPK可調(diào)控一些下游轉(zhuǎn)錄因子，如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponsive-elementbindingprotein，CREB），當(dāng)CREB接收到信號時會調(diào)節(jié)MITF的轉(zhuǎn)錄過程[9-10]，除了MAPK這個路徑，還有其他影響色素生成的重要途徑如c-kit信號和WNT/β-catenin通路。其中，WNT/βcatenin信號通路在胚胎發(fā)育中起重要的作用[11]。有研究表明，WNT/β-catenin信號通路也可影響黑色素瘤的生成[12]。WNT/β-catenin信號通路分泌WNT蛋白質(zhì)并與其受體Frizzled（FZD）結(jié)合組成復(fù)合物并相互作用，從而觸發(fā)一系列生化反應(yīng)[13-15]。

為了更好地了解miR-146a在毛發(fā)和皮膚顏色中可能的作用，本研究使用高通量測序，挖掘了miR-146a對的羊駝黑色素細(xì)胞的調(diào)控，旨在揭示許多由miR-146a調(diào)控的mRNA轉(zhuǎn)錄物，并提供對其潛在功能的深入了解。這些數(shù)據(jù)將有助于更好地了解黑色素沉著這一復(fù)雜的分子機(jī)制是怎樣形成的。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為4代羊駝黑色素細(xì)胞（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室提供）。Trizol試劑（Invitrogen，USA）和黑色素培養(yǎng)基（sciencell，美國）。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序培養(yǎng)羊駝7代黑色素細(xì)胞（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室保存的羊駝黑色素細(xì)胞），確保細(xì)胞狀態(tài)良好無污染。待細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后，使用1×的PBS清洗2～3次后，加入Trizol裂解液并立即置于液氮中。使用Trizol試劑根據(jù)制造商的說明書提取樣品中的總RNA。通過凝膠電泳評估RNA的完整性，并通過OD260/OD280與RIN值的比值檢查RNA的純度。選擇RIN值大于7.5并且OD260/OD280值大于1.7的RNA樣品進(jìn)行深度測序。

1.2.2 cDNA測序文庫的構(gòu)建及Illumina-Solexa高通量測序從羊駝黑色素細(xì)胞總RNA中分離pohy（A）mRNA，將分離的mRNA片段化，隨后使用隨機(jī)的第1鏈cDNA合成聚體引物。使用緩沖液、dNTP、RNaseH和DNA聚合酶I合成第2鏈cDNA。使用QiaQuick PCR提取試劑盒純化短cDNA片段。碎片末端被修復(fù)，A尾隨后連接測序適配器。在瓊脂糖凝膠電泳后選擇合適的大小片段，并用作PCR擴(kuò)增的模板。使用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行文庫的測序。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析在裝配之前，通過移除適配器和低質(zhì)量的讀數(shù)來清潔原始讀取。序列裝配使用短讀裝配程序Trinity（http：//www.genomics.cn）進(jìn)行。用一些數(shù)據(jù)庫（NR、Swiss-Prot、KEGG和COG）進(jìn)行了Blastx比對，如果不同數(shù)據(jù)庫的結(jié)果彼此沖突，當(dāng)確定序列方向時，遵循NR＞Swiss-Prot＞KEGG＞COG的優(yōu)先順序；如果序列與上述數(shù)據(jù)庫不一致時，則使用ESTScan軟件確定其序列方向。所有序列使用WEGO（http://wego.genomics.org.cn/cgibin/wego/index.pl）進(jìn)行GO功能分類。

1.2.4 鑒別差異表達(dá)基因和途徑分析基于前面描述的方法，嚴(yán)格算法用于鑒別試驗組和對照組之間差異表達(dá)的基因。使用FDR（假發(fā)現(xiàn)率）值0.001和＞2的RPKM比值分析，將差異表達(dá)基因（DEG）映射到GO數(shù)據(jù)庫的每個詞條上（http://www.geneontology.org/），計算每個詞條的基因數(shù)，并獲得每個GO術(shù)語的基因和基因數(shù)列表，并在KEGG途徑數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/path.html）的幫助下，進(jìn)一步研究了DEG。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)組裝分析

過濾原始數(shù)據(jù)后，獲得了miR-146a試驗組21 216 335次清潔讀數(shù)、53.15% GC百分比和NC對照組27 926 442次清潔讀數(shù)、52.82% GC百分比；這些清潔讀數(shù)組裝共得到161 666條序列，組裝完整性比較高。分別從試驗組和對照組中產(chǎn)生16 672 337、22 047 775條序列，并且確定序列的平均長度為641.73 nt，其中1 kb以上的序列共有20 019條（圖1）。

2.2 序列的功能分類

檢測羊駝黑色素細(xì)胞中序列對蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫的Blast分析（e值＜0.000 01）揭示了25 867個已知基因，其中4 848個通過COG分類分析注釋。根據(jù)它們推定的功能，將這些基因分成25個類別，12 667個基因也通過GO分類分析加以注釋（圖2），根據(jù)其推定的功能（圖3）分為3類（生物過程、細(xì)胞成分、分子功能），并列舉出羊駝黑色素細(xì)胞中最富集的GO條目（圖4）。

2.3 不同基因在miR-146a組和NC組中的差異表達(dá)及所涉及的KEGG路徑

使用先前描述的算法[16-17]，鑒定了試驗組和對照組之間差異基因的表達(dá)，共有292個已知基因差異表達(dá)，其中101個上調(diào)，191個下調(diào)。對于GO分析，將差異表達(dá)基因分別歸入細(xì)胞組分、分子功能和生物過程類別。大部分的差異表達(dá)基因分為2個GO類別，包括MAPK家族和c-kit、WNT/β-catenin信號通路的基因和4個未知基因（表1）。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機(jī)選擇了5個基因進(jìn)行實時PCR，以確定其在試驗組和對照組中的相對表達(dá)。實時PCR結(jié)果顯示，選擇的5個基因表達(dá)量顯著，與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)一致（圖5）。

表1 在miR-146a組和NC組中的差異表達(dá)基因及所涉及的KEGG路徑

3 結(jié)論與討論

哺乳動物的毛發(fā)顏色是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素決定的，黑色素細(xì)胞中合成2種初級黑色素（真黑素和褐黑素），這些黑色素的質(zhì)量以及產(chǎn)生的真黑色素和褐黑色素的比例，決定了頭發(fā)和皮膚的最終顏色[18-19]。已有研究報道，傳統(tǒng)的Sanger測序法可以從綿羊和羊駝皮中產(chǎn)生表達(dá)序列[20-21]。

為了進(jìn)一步研究miR-146可能在羊駝黑色素細(xì)胞中發(fā)揮的重要作用，本研究利用Illumina技術(shù)從過表達(dá)miR-146的羊駝黑色素細(xì)胞中產(chǎn)生了數(shù)個轉(zhuǎn)錄組序列。從這些數(shù)據(jù)讀取中發(fā)現(xiàn)，已知有161 666個序列在羊駝黑色素細(xì)胞中表達(dá)。這便為之后研究黑色素細(xì)胞的調(diào)控基因提供了基礎(chǔ)。從表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)與細(xì)胞功能相關(guān)。其中，與黑色素形成有關(guān)的MAPK信號通路，可以通過調(diào)控下游不同轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控黑色素的合成[22]。有報道發(fā)現(xiàn)，被激活的MAPK可以帶著信號去選擇性地激活下游基因[23-24]。黑素細(xì)胞發(fā)育過程中，影響黑素瘤形成的基因可能對黑色素細(xì)胞增殖和遷移有著重要的調(diào)控[25]。WNT/βcatenin通路常常被一些癌癥因子激活，然而，其調(diào)控下游基因的方式是不同的[14]。這些差異可能是與黑色素細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生物學(xué)以及β-catenin活化的多樣性有關(guān)。黑色素瘤中WNT/β-catenin信號通路的激活可能與WNT信號級聯(lián)成分或參與其調(diào)控的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)改變有關(guān)[26]。不依賴βcatenin的WNT信號傳導(dǎo)途徑是通過將WNT與FZD結(jié)合而啟動的，然后激活各種下游效應(yīng)子[14]。本研究對差異表達(dá)基因的GO通路分析也發(fā)現(xiàn)，許多基因要么是細(xì)胞的一部分，要么參與了細(xì)胞功能。本研究特別關(guān)注與色素沉著和黑色素生成相關(guān)的途徑。黑色素生成是一個復(fù)雜的生化級聯(lián)反應(yīng)，盡管黑素細(xì)胞的數(shù)量通常保持不變，但較深的皮膚色素沉著很可能會影響毛色，這便與更多黑素體的存在有關(guān)[27]。影響黑色素生成的因素很多，還有待進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果揭示了miR-146a在羊駝黑色素細(xì)胞中的生理功能，這將有助于了解miRNA在動物毛發(fā)和皮膚顏色發(fā)育中的影響。