孫林靜 張融雪 蘇京平 王勝軍 佟 卉 劉燕清 孫 玥

(天津市農(nóng)作物研究所，天津 300384)

泛素蛋白酶途徑在真核生物中是非常保守的，這個(gè)途徑由泛素活化酶E1 (ubiquitin activating enzyme) 、泛素結(jié)合酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme) 和泛素連接酶E3 (ubiquitin ligase enzyme) 協(xié)同工作。E1通過(guò)ATP依賴的方式與泛素共價(jià)結(jié)合，E2接受E1提供的泛素并與E3互作，E3識(shí)別并結(jié)合底物蛋白，然后將泛素轉(zhuǎn)移給底物蛋白，形成底物蛋白單泛素或者多泛素化[1]。

1 TMD-RING在植物生理過(guò)程中的作用

1.1 TMD-RING在非生物脅迫中的作用

AtATL78表達(dá)受低溫誘導(dǎo)但受干旱抑制，是一個(gè)膜定位RING泛素連接酶，刪除其跨膜域后定位于細(xì)胞質(zhì)，具有體外泛素連接酶活性，AtATL78 RNAi植株對(duì)低溫的耐受性增強(qiáng)，但是對(duì)干旱的耐受性減弱[2]。

GhSARP1 是一個(gè)定位于質(zhì)膜的C3H2C3類型的E3泛素連接酶，具有體外E3連接酶活性。GhSARP1在花后24、27和27DPA的葉片、花和纖維中轉(zhuǎn)錄水平較高，在根和莖中轉(zhuǎn)錄水平較低。GhSARP1的表達(dá)被鹽、低溫和ABA下調(diào)。過(guò)表達(dá)GhSARP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)和萌發(fā)后階段對(duì)鹽脅迫敏感，這表明GhSARP1可能負(fù)調(diào)控棉花中泛素化介導(dǎo)的鹽脅迫反應(yīng)[3]。

BnTR1是N末端具有2個(gè)跨膜域的C4HC3蛋白，具有體外泛素連接酶活性。在油菜和水稻中過(guò)表達(dá)該基因，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)熱脅迫的抗性。BnTR1可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣通道的活性參與調(diào)控鈣離子動(dòng)態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)熱擊轉(zhuǎn)錄因子和熱擊蛋白表達(dá)量上調(diào)，從而正調(diào)控植物熱脅迫耐受性[4]。

OsHIR1是定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核的C3H2C3類型RING泛素連接酶，其表達(dá)受到砷和鎘誘導(dǎo)。在擬南芥中過(guò)表達(dá)OsHIR1能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷和鎘的耐受性，OsHIR1能與OsTIP4;1相互作用，并通過(guò)26S蛋白酶體介導(dǎo)其降解，減少轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷和鎘的吸收從而增強(qiáng)對(duì)重金屬耐受性[5]。

AtSTRF1是定位于質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)小體的RING蛋白，受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。該基因的缺失突變體幼苗根部的內(nèi)吞加速，膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量改變，對(duì)鹽、離子和滲透脅迫耐受性增強(qiáng)，在鹽脅迫下的活性氧積累減少。蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA(brefeldin A)處理突變體后，BFA小體數(shù)目增加，結(jié)果表明AtSTRF1是一個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)泛素連接酶，能夠調(diào)節(jié)鹽脅迫下內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和活性氧的產(chǎn)生[6]。

AtCHYR1含有1個(gè)CHY鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。AtCHYR1受ABA和干旱誘導(dǎo)表達(dá)，主要表達(dá)在維管束和氣孔中。AtCHYR1促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和活性氧產(chǎn)生，增強(qiáng)植物耐旱性。SnRK2.6能夠磷酸化AtCHYR1的178位蘇氨酸，該磷酸化位點(diǎn)的破壞能導(dǎo)致AtCHYR1功能喪失[7]。PeCHYR1是AtCHYR1的同源基因，定位于細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也受ABA和干旱誘導(dǎo)表達(dá)。過(guò)表達(dá)PeCHYR1的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)H2O2產(chǎn)生顯著增強(qiáng)，氣孔孔徑減小。與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)外源ABA表現(xiàn)出更高的敏感性。此外，PeCHYR1的上調(diào)促進(jìn)了氣孔的閉合，減少了蒸騰作用，使得水分利用效率顯著提高，并維持較高的光合活性和生物量積累。這些結(jié)果表明，PeCHYR1通過(guò)ABA誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，在提高抗旱性方面起著至關(guān)重要的作用[8]。

AtSPL1含有2個(gè)跨膜域和1個(gè)C3HC4類型RING結(jié)構(gòu)域，定位于線粒體和過(guò)氧化物酶體，該基因突變體導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體β氧化活性下降，SPL1降低了SP1誘導(dǎo)PEX13的翻轉(zhuǎn)能力[9]。

MfSTMIR含有1個(gè)跨膜域和1個(gè)C3H2C3類型RING結(jié)構(gòu)域，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。MfSTMIR表達(dá)受鹽、干旱和衣霉素誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥和苜蓿中過(guò)表達(dá)MfSTMIR均能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐受性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)分子伴侶BiP1/2和BiP3的表達(dá)量在過(guò)表達(dá)植株中上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，在過(guò)表達(dá)MfSTMIR的截形苜蓿中，MfSTMIR能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的泛素結(jié)合酶MtUBC32以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通道亞基MtSec61γ相互作用，并且不影響互作蛋白的穩(wěn)定性。在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，MfSTMIR能夠促進(jìn)ERAD相關(guān)底物MtCPY*的降解。上述結(jié)果表明MfSTMIR可能通過(guò)與MtUBC32和MtSec61γ相互作用，以ERAD方式清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊蛋白來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)植物的損害[10]。

AtXBAT35.2是定位于高爾基體的RING蛋白，該基因功能缺失增強(qiáng)了對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性，而過(guò)表達(dá)增加了敏感性，這與XBAT35.2介導(dǎo)ACD11的蛋白酶體依賴降解一致。這表明在非生物脅迫下，ACD11高表達(dá)能增強(qiáng)植物耐性，當(dāng)XBAT35.2積累進(jìn)而促進(jìn)ACD11的降解，從而降低了脅迫耐受性[11]。

1.2 TMD-RING在植物激素信號(hào)通路中的作用

XERICO (Greek for drought tolerant ) 是一個(gè)含有N末端跨膜的RING-H2類型泛素連接酶，過(guò)表達(dá)XERICO擬南芥抗旱性增強(qiáng)但是對(duì)高鹽和滲透脅迫敏感；ABA合成途徑關(guān)鍵酶NCED3表達(dá)量上調(diào)，ABA合成量增加，ABA響應(yīng)基因顯著上調(diào)表達(dá)。XERICO能與AtUBC8和AtTLP9 (TUBBY-like protein 9) 相互作用，AtTLP9是多亞基RING泛素連接酶的底物識(shí)別因子F-box，可能將XERICO作為底物蛋白識(shí)別，還有可能是被XERICO作為底物識(shí)別，這些有待進(jìn)一步研究證明[12]。

以上非生物脅迫相關(guān)的SDIR1、AIRP1、AIRP3、RHA2a和RHA2b均參與了ABA信號(hào)途徑。AtRSL1 (RING finger of seed longevity 1) 是質(zhì)膜定位的C5HC2類型的RING泛素連接酶，C末端含有一個(gè)跨膜域，能與ABA受體PYL4和PYR1在質(zhì)膜上相互作用并促進(jìn)這兩個(gè)受體的降解。過(guò)表達(dá)RSL1植株對(duì)ABA不敏感，而RSL1的RNAi植株對(duì)ABA超敏感，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的響應(yīng)也發(fā)生了改變[13]。

XBAT35在植物中是ABA反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子，通過(guò)VPS23A/PYL4復(fù)合物發(fā)揮作用，特別是通過(guò)加速VPS23A的周轉(zhuǎn)，從而增加ABA受體PYL4的積累[14]。

1.3 TMD-RING在植物防御反應(yīng)中的作用

擬南芥RING1具有多個(gè)跨膜域，定位于質(zhì)膜脂筏。正常條件下RING1表達(dá)量在各個(gè)組織中比較低，當(dāng)病原菌侵染或者PCD誘導(dǎo)劑FB1 (Fumonisin B1) 處理能夠誘導(dǎo)該基因表達(dá)，利用RNAi技術(shù)降低該基因表達(dá)可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株對(duì)FB1超敏感[15]。

擬南芥ATL9是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的RING泛素連接酶，植物防御反應(yīng)相關(guān)激素如水楊酸和茉莉酸不能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，但是幾丁質(zhì)可以誘導(dǎo)，并且這種誘導(dǎo)依賴NADPH氧化酶。對(duì)atl9突變體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示幾丁質(zhì)信號(hào)途徑和幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的防御反應(yīng)相關(guān)基因可能是ATL9的下游基因，ATL9可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)降解過(guò)程[16]。

辣椒中的CaRING1受無(wú)毒性的野油菜黃單胞菌誘導(dǎo)表達(dá)，含有一個(gè)N末端跨膜域和C末端RING finger，定位于質(zhì)膜并具有泛素連接酶活性。病毒誘導(dǎo)CaRING1沉默并使植物超敏反應(yīng)受損，增加植物對(duì)辣椒瘡痂病菌的感染，在擬南芥中過(guò)表達(dá)CaRING1可增強(qiáng)植株對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種的抗性[17]。

AtXBAT35.2是定位于高爾基體的RING蛋白，參與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)和病原體反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在煙草葉片中過(guò)表達(dá)XBAT35.2，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞死亡，而且這種方式需要其RING結(jié)構(gòu)域。XBAT35缺失突變破壞了植物抵御病原體攻擊的能力，而XBAT35.2基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)病原體的抵抗力。XBAT35.2能夠自身降解，接種丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000的毒株和無(wú)毒株后，則阻止這種降解。XBAT35.2在植物中與防御相關(guān)的ACD11相互作用，并促進(jìn)其降解，用蛋白酶體抑制劑處理轉(zhuǎn)基因幼苗會(huì)導(dǎo)致ACD11的積累，這表明XBAT35.2在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和防御病原體方面起作用[18]。

1.4 TMD-RING在植物養(yǎng)分代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用

AtATL31定位于質(zhì)膜，在植物碳氮代謝平衡和感知方面起作用。過(guò)表達(dá)ATL31的轉(zhuǎn)基因植株在碳氮平衡失調(diào)時(shí)仍然能夠正常萌發(fā)并生長(zhǎng)。ATL31能與14-3-3χ相互作用并使之泛素化降解， 14-3-3χ的缺失突變體與過(guò)表達(dá)ATL31類似，這表明ATL31通過(guò)調(diào)控14-3-3χ蛋白積累量參與植物碳氮代謝感知[19]。

AtSIS3是含有3個(gè)跨膜域的C3H2C3類型RING泛素連接酶，具有體外泛素連接酶活性，sis3在外源添加高濃度葡萄糖時(shí)仍然能夠萌發(fā)，但是對(duì)外源ABA的響應(yīng)與野生型類似。這表明SIS3僅在葡萄糖信號(hào)通路中起作用，不參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。

AtATL15是一個(gè)N末端具有跨膜域的RING泛素連接酶，能夠影響擬南芥對(duì)蔗糖的信號(hào)響應(yīng)。蔗糖誘導(dǎo)ATL15的下調(diào)表達(dá)，ATL15定位于質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)。進(jìn)一步的遺傳分析表明,atl15敲除突變體對(duì)高蔗糖濃度不敏感, 而ATL15過(guò)表達(dá)抑制植物生長(zhǎng)。此外, 內(nèi)源性葡萄糖和淀粉量在atl15敲除突變體和ATL15過(guò)表達(dá)植株中均受到影響[21]。

AtLOG2 (Loss of GDU2) 主要定位于質(zhì)膜，能與同樣定位于質(zhì)膜的GDU1 (Glutamine dumper1) 相互作用，并且二者的組織表達(dá)都位于木質(zhì)部和韌皮組織，AtLOG2通過(guò)與GDU1的相互作用調(diào)控了植物細(xì)胞氨基酸的外向轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。

OsNLA1是定位于質(zhì)膜的RING類型泛素連接酶，能夠介導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPT2/PT8的降解，OsNLA1的突變體導(dǎo)致葉片磷濃度增加，并且是非氮素依賴型的。OsNLA1與泛素結(jié)合酶PHO2沒(méi)有相互作用，PHO2不是OsNLA1介導(dǎo)OsPT2/PT8的E2[23]。

2 結(jié)論與展望

目前對(duì)膜定位的泛素連接酶有一些研究報(bào)道，但對(duì)比預(yù)測(cè)膜定位的泛素連接酶數(shù)量，已知功能的基因還是相對(duì)較少的，對(duì)此在今后的研究中需要關(guān)注以下幾個(gè)方面的研究。首先是TMD-RING E3泛素連接酶底物的鑒定，相比核定位蛋白，膜蛋白的互作蛋白更難以篩選，可以通過(guò)去除跨膜域或者利用分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行底物篩選鑒定，并且通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證篩選到的互作蛋白的真實(shí)性。第二方面是葉綠體及線粒體等細(xì)胞器膜定位的TMD-RING E3泛素連接酶的報(bào)道較少，對(duì)于此類亞細(xì)胞定位的E3泛素連接酶的功能應(yīng)予以關(guān)注。第三方面，對(duì)于TMD-RING E3泛素連接酶在干旱、鹽、低溫等非生物脅迫下或者是病菌侵染條件下，亞細(xì)胞定位是否發(fā)生改變也應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注，因?yàn)槎ㄎ坏母淖冎苯佑绊懝δ?。第四方面，TMD-RING E3泛素連接酶在非生物脅迫方面的功能研究較多，而其他功能方面研究也應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注。細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞的生理過(guò)程具有重要作用，應(yīng)當(dāng)對(duì)含有跨膜域的RING E3泛素連接酶進(jìn)行更多的研究，以揭示其功能，了解更多的作用條件模式，以豐富對(duì)細(xì)胞生化過(guò)程的調(diào)節(jié)認(rèn)知。