徐愛(ài)蘭 趙蘊(yùn)偉

在全球范圍內(nèi)，肺癌是癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因，肺癌是最常見(jiàn)的癌癥，也是男性癌癥死亡的主要原因，其次是前列腺癌和結(jié)直腸癌(發(fā)病率)以及肝癌和胃癌(死亡率)。癌癥死亡的主要原因在不同國(guó)家和地區(qū)存在很大差異，這主要取決于社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度以及相關(guān)的生活方式因素[1]。已知吸煙是導(dǎo)致肺癌的重要因素之一。但是人們?cè)?0歲以前，性別和吸煙這兩個(gè)因素對(duì)肺癌發(fā)病發(fā)展的影響并不大。我國(guó)女性的吸煙率低，但是我國(guó)女性的肺癌的發(fā)病率很高，這可能與她們長(zhǎng)期接觸油煙、二手煙，煙霧暴露增加，以及環(huán)境的污染等因素相關(guān)[1]。在組織學(xué)分型中，肺癌主要是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌又可分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，同時(shí)存在基因以及組織學(xué)方面的異質(zhì)性，這些導(dǎo)致肺癌在治療方面具有一定的難度。盡管多年的研究和醫(yī)療方面取得進(jìn)步，肺癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。常規(guī)癌癥治療，如化療和放射治療，表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用，包括胃腸道不適、器官損害和低質(zhì)量生活[3]。在臨床中的大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)肺癌時(shí)，可能已經(jīng)是中晚期階段，所以肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷對(duì)癌癥疾病的治愈具有重要意義[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，核酸適配體(Aptamer)作為一種新型的高親和力、高特異性生物識(shí)別配體在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究中變得越來(lái)越重要。所以本文就核酸適配體在肺癌中的研究及其應(yīng)用進(jìn)展的情況作一綜述。

核酸適配體

一、核酸適配體的特點(diǎn)

核酸適配體是單鏈DNA(SsDNA)或RNA序列，通過(guò)指數(shù)富集(SELEX)技術(shù)系統(tǒng)進(jìn)化配體從隨機(jī)文庫(kù)中選擇[5-6]。它們以高親和力和特異性與相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)結(jié)合，并且具有快速靶向腫瘤穿透的能力[7]。核酸適配體可以應(yīng)用于各種疾病的治療，尤其包括肺癌等癌癥，因?yàn)樗鼈兙哂泻軓?qiáng)的中和活性[8]。早在1990年，Tuerk等報(bào)道了一種新型的寡核苷酸篩選技術(shù),該技術(shù)與 PCR 擴(kuò)增相結(jié)合，在體外人工構(gòu)建的短鏈核苷酸文庫(kù)中篩選出RNA核酸適配體[9]。核酸適配體可以折疊成三維結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)形成不同的形狀結(jié)合到目標(biāo)上，比如有發(fā)夾的結(jié)構(gòu)、呈凸環(huán)狀、還有的是四角環(huán)狀等，并通過(guò)形狀識(shí)別對(duì)應(yīng)物的方式結(jié)合到目標(biāo)上，主要是通過(guò)范德華力、氫鍵、堿基堆積力等與靶標(biāo)具有很高的特異性和親和力[8,10]。針對(duì)核酸適配體對(duì)靶點(diǎn)具有高度的親和力和特異性的特點(diǎn)，所以核酸適配體又稱為“化學(xué)抗體”，而且它的應(yīng)用范圍很廣，從目標(biāo)檢測(cè)、傳遞到藥物應(yīng)用等[11]。

二、核酸適配體與抗體的比較

有研究表明，一般在動(dòng)物身上開(kāi)發(fā)的單克隆抗體，這種單克隆抗體在臨床應(yīng)用前是人源化的[11]。因此，生產(chǎn)治療性單克隆抗體需要使用非常大的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，而且需要在良好生產(chǎn)規(guī)范的條件下進(jìn)行廣泛的純化，生產(chǎn)成本高?？贵w需要體外或體內(nèi)生產(chǎn)，這可能會(huì)增加批次之間的差異?？偟膩?lái)說(shuō)，高生產(chǎn)成本、安全性和短保質(zhì)期，限制了這些抗體的廣泛使用[11]。所以，在許多方面，核酸適配體相對(duì)抗體來(lái)說(shuō)具有多種優(yōu)勢(shì)，它們是中等分子大小，介于抗體和小分子之間[8]。它在體外化學(xué)合成時(shí)會(huì)減少批次之間的差異[12]，并且主要是以低成本，比單克隆抗體便宜數(shù)千倍，以及以高純度來(lái)進(jìn)行化學(xué)合成[11]，可以作為生物特異性識(shí)別分子成功地與抗體競(jìng)爭(zhēng)，并且可以針對(duì)幾乎任何靶標(biāo)進(jìn)行選擇，而且核酸適配體具有低分子量、無(wú)毒性和非免疫原性等特點(diǎn)[13]。非免疫原性和無(wú)毒的原因主要是由于核酸適配體的組成部分是核酸[14-15]。與大的單克隆抗體(約150 kDa)相比，核酸適配體的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是它們的大小(5～15 kDa)[16]。因?yàn)楹怂徇m配體比抗體小得多，所以核酸適配體具有更好的組織穿透能力以及更強(qiáng)的腫瘤組織內(nèi)化能力[12,17]。而且，核酸適配體分子量小，可以結(jié)合那些較大的抗體無(wú)法發(fā)現(xiàn)的隱藏的表位[18]。

三、核酸適配體的篩選

核酸適配體的體外篩選的方式是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)產(chǎn)生的。核酸適配體的SELEX篩選技術(shù)發(fā)展很迅速。比如混合SELEX[19]、消減SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX[20]等。由于核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)產(chǎn)生的，所以核酸適配體對(duì)靶目標(biāo)具有高度的親和力和特異性。核酸適配體的產(chǎn)生需要經(jīng)歷反復(fù)的孵化、洗滌、分離、擴(kuò)增的一系列步驟[21]。最初的文庫(kù)由隨機(jī)的RNA和DNA分子組成，與目標(biāo)物、生物標(biāo)記物、蛋白質(zhì)甚至整個(gè)細(xì)胞一起培養(yǎng)孵育。在孵育后，洗去未結(jié)合的序列，來(lái)分離和分離結(jié)合的序列。將結(jié)合序列從目標(biāo)中洗脫出來(lái)，用聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)(基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以產(chǎn)生序列豐富的序列庫(kù)[18]。產(chǎn)生的序列庫(kù)要經(jīng)歷一輪又一輪的選擇和擴(kuò)增等循環(huán)步驟，每一輪的循環(huán)都會(huì)降低序列庫(kù)的異質(zhì)性來(lái)進(jìn)一步增加核酸適配體的親和力和特異性[18]，在進(jìn)行親和力分析后，把具有最好的親和力和特異性的序列池進(jìn)行克隆和測(cè)序，或者進(jìn)行下一代測(cè)序，來(lái)確保核酸適配體的敏感性和特異性。

四、核酸適配體的修飾

核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用中有一些局限性。在人血清中，由于核酸酶的存在，未經(jīng)修飾的RNA和DNA核酸適配體都容易降解，其中RNA更敏感，因?yàn)楹颂俏恢糜?0個(gè)羥基[18,21]。所以人體血清中的核酸酶加大對(duì)核酸適配體降解的敏感性，由于核酸適配體是相對(duì)較小的分子(5～15 kDa)，它們很容易被腎臟排泄[15]。這些問(wèn)題都制約著核酸適配體的進(jìn)一步研究及應(yīng)用。

隨著核酸化學(xué)的發(fā)展，可以進(jìn)一步對(duì)核酸適配體進(jìn)行合成和修飾，增強(qiáng)對(duì)肺腺癌等惡性腫瘤具有高度特異性的分子顯像功能，增加選擇性和特異性，以及與癌癥生物標(biāo)記物結(jié)合的能力，更有助于靶向成像[22]。防止核酸外切酶降解核酸適配體的一種常見(jiàn)方法是限制核酸鏈的30和/或50端[23]，研究延緩核酸適配體從血液中排泄，以及改善它的藥代動(dòng)力學(xué)的解決方案是與膽固醇或聚乙二醇結(jié)合，稱為聚乙二醇化，通過(guò)二者結(jié)合來(lái)增加低分子物質(zhì)的血清保留時(shí)間[15,24]。為了增加對(duì)核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的降解的穩(wěn)定性，可以用硫取代磷酸骨架來(lái)修飾核苷酸間連接，創(chuàng)建硫代磷酸鍵，增加核酸適配體的穩(wěn)定性[24-25]。RNA核酸適配體，可以通過(guò)修飾核糖的高度核酸酶敏感的20-羥基來(lái)增加血清半衰期和核糖核酸酶抗性[18,21]，這些修飾包括用氟(F)、烷基、氨基(NH2)或硫基取代20-羥基。修飾的核苷酸可以在SELEX的篩選過(guò)程之前或者之后進(jìn)行，因?yàn)樾揎椀暮塑账岷蚐ELEX的步驟不能同時(shí)進(jìn)行，而且在篩選之后的修飾更容易、更便宜，但可能會(huì)對(duì)核酸適配體的結(jié)合屬性和功能產(chǎn)生一定的影響[22]。

核酸適配體的遞送系統(tǒng)

核酸適配體在臨床治療及應(yīng)用中的研究越來(lái)越深入，核酸適配體需要相應(yīng)的遞送系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮其治療作用。

在之前的報(bào)道中，mRNA-29b在mRNA 29家族中表達(dá)最豐富[26]。mRNA-29b通過(guò)控制細(xì)胞分化、凋亡和增殖在肺癌治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-30]。mRNA 29b在肺癌細(xì)胞中下調(diào)或者沉默，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，所以mRNA 29b是一種很大潛力的癌癥候選基因。但是，它們的治療應(yīng)用由于缺乏有效的遞送系統(tǒng)而受到限制。所以，Wu[31]等人利用合成的CuO(氧化銅)納米顆粒開(kāi)發(fā)了一種新的核酸適配體連接的雜交遞送系統(tǒng)，利用香鞘提取物制備CuO納米粒子，將CuO納米顆粒與MUC1(粘蛋白1)核酸適配體偶聯(lián)，體外將miRNA29b導(dǎo)入肺癌細(xì)胞。將miRNA-29b遞送到A549細(xì)胞。這種遞送系統(tǒng)可以有效地將miRNAs遞送到癌細(xì)胞，成為細(xì)胞內(nèi)傳遞miRNA的有效平臺(tái)，進(jìn)一步改善肺癌的治療結(jié)果。此外，Perepelyuk[32]等人研究的是核酸適配體-雜化納米顆粒生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，同樣是選擇性地將miRNA-29b遞送到表達(dá)MUC1(粘蛋白1)的癌細(xì)胞。因?yàn)镸UC1是一種跨膜蛋白，在NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)中異常過(guò)表達(dá)[33],在大約80%的肺腺癌中過(guò)表達(dá)。所以可以利用它在NSCLC中的過(guò)表達(dá)，通過(guò)將MUC1核酸適配體偶聯(lián)到混合納米顆粒表面，實(shí)現(xiàn)miRNA-29b對(duì)NSCLC的最佳靶向治療。Rab蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)受體轉(zhuǎn)運(yùn)的GTPase家族之一，MUC-1核酸適配體是NSCLC A549細(xì)胞強(qiáng)有力的結(jié)合配體，在Liu[34]等人的研究中，利用精確定制的DNA棱鏡將GTPase Rab26作為新的潛在治療靶點(diǎn)用于肺癌的靶向治療。通過(guò)設(shè)計(jì)合成了一種具有可調(diào)靶向和siRNA負(fù)載能力的DNA棱鏡平臺(tái)。通過(guò)交換兩個(gè)短的單鏈DNA，核酸適配體和siRNA的數(shù)目和位置都可以在每個(gè)納米棱鏡的1到6之間調(diào)節(jié)。因?yàn)镸UC-1核酸適配體是NSCLC A549細(xì)胞的結(jié)合配體，其靶向效率與棱鏡結(jié)構(gòu)上的核酸適配體數(shù)目呈正相關(guān)。精確控制納米結(jié)構(gòu)上核酸適配體的能力對(duì)開(kāi)發(fā)靶向遞送系統(tǒng)起著重要作用。所以在研究中，Rab26siRNA與MUC-1核酸適配體聯(lián)合應(yīng)用對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)具有良好的抗腫瘤作用[34]。肺癌干細(xì)胞(CSCs)被認(rèn)為是肺癌的種子細(xì)胞，CD133是肺CSCs的標(biāo)志物，在Huang[35]等人的研究中，通過(guò)DSPE-PEG2000制成的納米膠束作為藥物輸送系統(tǒng)，增加吉非替尼的溶解性和對(duì)肺CSCs的靶向性。該團(tuán)隊(duì)[35]開(kāi)發(fā)了載吉非替尼的聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺納米膠束和CD133核酸適配體(M-Gef-CD133)來(lái)消除CD133+的肺CSCs。通過(guò)研究，M-Gef-CD133能有效地將吉非替尼轉(zhuǎn)運(yùn)至CD133+肺CSCs，并誘導(dǎo)對(duì)CD133+肺CSCs的選擇性殺傷作用[35]。APT是單鏈寡核苷酸的核酸適配體，是腫瘤細(xì)胞靶向的優(yōu)良核酸適配體，S15-APTs是一種有效的腫瘤細(xì)胞靶向配體，即單鏈寡核苷酸為基礎(chǔ)的S15核酸適配體(S15-APTs)，S15-APTs修飾納米顆粒(NPs)，可以實(shí)現(xiàn)選擇性的NSCLC靶向。APT修飾的量子點(diǎn)對(duì)靶細(xì)胞A549具有選擇性結(jié)合和內(nèi)化作用[36]。針對(duì)APT作為主動(dòng)藥物靶向腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用，Engelberg[36]等人研究了S15-APT內(nèi)化到人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的機(jī)制，即人類NSCLC細(xì)胞選擇性內(nèi)化這些S15-APT量子點(diǎn)是通過(guò)經(jīng)典的依賴于籠蛋白的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)可用于開(kāi)發(fā)基于S15 APT修飾的NPs的主動(dòng)靶向給藥和診斷系統(tǒng)，這些NPs可以通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用選擇性地進(jìn)入NSCLC，從而繞過(guò)MDR(多重耐藥)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些新的發(fā)現(xiàn)對(duì)于APT靶向藥物傳遞NPs具有重要的意義。生物相容性嵌段共聚物peg-pcl包埋疏水性化療藥物紫杉醇(Ptx)的NPs，該納米顆粒以人NSCLC細(xì)胞為靶點(diǎn)，它的基礎(chǔ)是聚乙二醇(PEG)與聚己內(nèi)酯(PCL)形成PEG-PCL膠束，并以APTS為靶向基團(tuán)[37]。這些APT-NPs選擇性地將PTX靶向NSCLC A549細(xì)胞，對(duì)人A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞有較高的選擇性，以及較強(qiáng)的殺滅作用。所以通過(guò)研究表明，這些修飾的納米粒在不損害正常組織的情況下，在選擇性靶向和根除人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞方面具有巨大的臨床前景[37]。

核酸適配體在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到的高親和力和特異性的核酸適配體，由于自身相對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)對(duì)環(huán)境溫度更加穩(wěn)定、無(wú)毒、非免疫原性，以及具有更強(qiáng)的腫瘤組織穿透能力，在從治療、藥物遞送、診斷、功能基因組學(xué)到生物傳感等多種應(yīng)用中的潛力越來(lái)越突出。

一、核酸適配體作為傳感元件

在Bashmakova[13]等人的研究中，主要以DNA核酸適配體作為發(fā)光傳感元件，以高靈敏度和特異性去區(qū)分肺癌患者和健康病例，它主要以重組Ca2+(鈣離子)調(diào)節(jié)的光蛋白(obelin)作為高靈敏的生物發(fā)光報(bào)告分子，來(lái)檢測(cè)肺部血液中的腫瘤元素。該研究也表明了核酸適配體作為發(fā)光傳感元件在肺癌檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值很大，以及在未來(lái)的研究中將會(huì)有更大的潛力。

二、核酸適配體作為載體

Abnous[38]等人通過(guò)在研究中發(fā)現(xiàn)兩種核酸適配體組成的十字形DNA納米結(jié)構(gòu)，這兩種核酸適配體是AS1411(26聚體DNA核酸適配體)和FOXM1(ssDNA核酸適配體與Forkhead Box蛋白M1結(jié)合)，這種十字納米結(jié)構(gòu)有助于將抗癌藥物阿霉素(Dox)靶向傳遞給癌細(xì)胞，同時(shí)減少對(duì)非靶細(xì)胞的損害和毒性作用。而且還表明FOXM1蛋白的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖有關(guān)[38].

三、核酸適配體作為靶向及放射性藥物

靶向癌癥治療可以提高治療選擇性和療效。在Russo[39]等人的研究中，將核酸適配體miR-34c和核酸適配體GL21.T相結(jié)合，二者的結(jié)合對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖有一定的影響。核酸適配體(GL21.T)，結(jié)合并抑制AXL(跨膜受體酪氨酸激酶家族(RT Ks)的Axl亞家族)跨膜受體。而且，將miR-34c偶聯(lián)到GL21.T核酸適配體作為靶向部分，以選擇性傳遞給表達(dá)AXL的NSCLC細(xì)胞，可以影響NSCLC細(xì)胞增殖，并能夠通過(guò)靶向AXL受體克服了獲得性RTK(受體型酪氨酸激酶)抑制劑的耐藥性。因此，GL21.T/miR-34c嵌合體在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)AXL具有雙重抑制作用，是治療NSCLC的一種新的治療工具[39]。

在Hamamoto[8]等人研究得出了FGF2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)核酸適配體抑制FGF2-FGFR途徑驅(qū)動(dòng)的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，即FGF2核酸適配體對(duì)FGF2依賴性肺癌細(xì)胞的治療是有效的，這些發(fā)現(xiàn)提供了臨床前的證據(jù)，證明核酸適配體對(duì)癌癥的治療是有作用的，并且在臨床的應(yīng)用潛力很大。

Zhao等人的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)為A549腺癌(非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型)開(kāi)發(fā)了S6核酸適配體探針[40]，核酸適配體探針對(duì)NSCLC腺癌和NSCLC大細(xì)胞癌細(xì)胞有選擇性結(jié)合，但與正常細(xì)胞的結(jié)合特性很小。這對(duì)于檢測(cè)癌細(xì)胞很重要。Zhang[41]等人的研究采用抗A549肺癌細(xì)胞的核酸適配體S6對(duì)漿膜腔積液中的癌細(xì)胞進(jìn)行分化，而且研究證實(shí)細(xì)胞特異性核酸適配體可成功應(yīng)用于ICC(免疫細(xì)胞化學(xué))快速診斷腺癌細(xì)胞，它具有更高的特異性和敏感度。

在Nuzzo[42]等人的研究中提供了由核酸適配體(GL21.T)和miR-137組成的核酸適配體-microRNA(MiR)復(fù)合物(AMIC)，該核酸適配體能夠結(jié)合和拮抗致癌受體Axl，減少細(xì)胞遷移和腫瘤生長(zhǎng)的能力。通過(guò)研究表明，GL21.T-137復(fù)合物能有效抑制NSCLC小鼠移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。并且GL21.T-137復(fù)合物在癌癥治療中具有廣泛的適用性，是治療非小細(xì)胞肺癌的潛在工具。

Zhou[43]等人通過(guò)SELEX細(xì)胞產(chǎn)生的核酸適配體作用于小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞，鑒定出了一種新的小細(xì)胞肺癌蛋白生物標(biāo)記物，即高密度脂蛋白結(jié)合蛋白(HDLBP)。在該研究中的免疫組化的結(jié)果顯示小細(xì)胞肺癌組織中的HDLBP水平升高。用核酸適配體siRNA抑制HDLBP的表達(dá)，從而在體外抑制了SCLC細(xì)胞的增值和轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)抑制了腫瘤的形成，并且抑制HDLBP的表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[43]。

展 望

核酸適配體因?yàn)榫哂懈叨扔H和力、高特異性等特點(diǎn)，使其在臨床腫瘤的診斷和治療中的作用越來(lái)越突出。核酸適配體介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)也會(huì)隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，在疾病的治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。核酸適配體現(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)研究和藥物篩選等領(lǐng)域中的重要工具，在疾病臨床診斷與治療方面已經(jīng)有了一些實(shí)際的應(yīng)用并具有巨大的潛能，以及隨著 SELEX 的技術(shù)不斷完善和化學(xué)修飾方法的進(jìn)步，將會(huì)有越來(lái)越多的針對(duì)腫瘤治療與診斷的核酸適配體從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于臨床。