何元毅，詹柳娟，黃光明

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230026)

紙噴霧離子源(Paper spray ionization,PSI)[1]作為敞開(kāi)式大氣壓離子源(Ambient ionization)技術(shù)之一，已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)生物流體中的藥物及其代謝物[2-3]、蛋白質(zhì)[4]、食品與環(huán)境中的污染物[5]和細(xì)菌中脂質(zhì)[6-7]等。PSI具有集采樣、樣品分離和離子化于一體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，大大地簡(jiǎn)化了質(zhì)譜分析步驟，提高了樣品分析速度；紙基質(zhì)具有色譜層析作用，可有效地減少離子抑制和基質(zhì)效應(yīng)；紙具有多孔性結(jié)構(gòu)，不會(huì)造成堵塞，可直接分析液態(tài)和固態(tài)復(fù)雜樣品；紙基質(zhì)環(huán)境友好，生物相容性好，便于生物樣品的儲(chǔ)存運(yùn)輸；裝置簡(jiǎn)單，便于和微型質(zhì)譜儀聯(lián)用。然而，在分析復(fù)雜生物樣品時(shí)，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，紙噴霧質(zhì)譜的檢測(cè)性能仍然會(huì)大打折扣[8]。

近年來(lái)，許多研究工作致力于在紙噴霧質(zhì)譜中聯(lián)用如免疫分析[9-11]、固相萃取/固相微萃取(SPE/SPME)[12-13]和液液萃取[14]等凈化富集技術(shù)以提升方法性能。PSI-MS與免疫技術(shù)聯(lián)用，利用免疫反應(yīng)的特異性結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)高選擇性富集被分析物，具有其他方法難以替代的優(yōu)勢(shì)。PSI-MS與固相萃取/固相微萃取技術(shù)聯(lián)用，可將被分析物富集在固定相上，提升選擇性和靈敏度，無(wú)需制備反應(yīng)，重現(xiàn)性較好。PSI-MS與液液萃取技術(shù)聯(lián)用，可將萃取溶劑作為噴霧溶劑，實(shí)現(xiàn)微量樣品的在線萃取、分析，降低樣品基質(zhì)復(fù)雜性，提高分析精確度和靈敏度。其對(duì)樣品量要求小，使用一次性材料，無(wú)需清洗步驟，具有較好的實(shí)用性。Damon等[14]在疏水化處理的紙基質(zhì)上，實(shí)現(xiàn)了4 μL生物樣品的在線液液萃取和定量分析。PSI-MS與液液萃取聯(lián)用，使用疏水化處理[15-18]的紙，樣品擴(kuò)散作用弱，易實(shí)現(xiàn)液液萃?。皇褂靡宜嵋阴プ鳛閲婌F溶劑，其與生物樣品互不相溶，對(duì)于弱極性物質(zhì)具有較好的萃取和離子化效果[19]。然而，乙酸乙酯在紙基質(zhì)上擴(kuò)散嚴(yán)重，導(dǎo)致蒸發(fā)速度過(guò)快，萃取效率低且噴霧時(shí)間短，降低了信號(hào)強(qiáng)度[20-21]。因此，PSI-MS與液液萃取的聯(lián)用需發(fā)展一種噴霧時(shí)間長(zhǎng)，且能提高被分析物的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的方法。

本研究提出一種水凝膠涂覆紙噴霧離子化的方法。瓊脂糖在紙表面發(fā)生物理交聯(lián)，形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠[22]。水凝膠具有限制溶液擴(kuò)散的作用[23]，在水凝膠涂覆的紙基質(zhì)上滴加的溶液，可在一定時(shí)間內(nèi)保持液滴狀態(tài)，減少揮發(fā)面積。在瓊脂糖涂覆的紙基質(zhì)表面滴加互不相溶的生物流體樣品液滴和噴霧溶劑液滴，即可實(shí)現(xiàn)更有效的液液萃取，延長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)時(shí)間的同時(shí)，提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。本方法材料制作簡(jiǎn)單，分析方法快速，且無(wú)需前處理，可直接快速完成微量生物流體樣品中治療藥物的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

卡馬西平、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、阿替洛爾、兔全血、瓊脂糖購(gòu)自Sangon Biotech公司；普萘洛爾、卡馬西平10，11-環(huán)氧化合物購(gòu)自阿拉丁公司；阿米替林、阿米替林-D6、甲醇(純度≥99.9%)購(gòu)于百靈威公司；乙酸乙酯(純度≥99.5%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；人尿樣來(lái)自實(shí)驗(yàn)室志愿者；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水(美國(guó)Millipore超純水儀制備)；色譜紙為Whatman 1 CHR(200 mm×200 mm)。其中，阿米替林-D6、普萘洛爾、卡馬西平10，11-環(huán)氧化合物、磺胺甲基嘧啶分別為阿米替林、阿替洛爾、卡馬西平和磺胺二甲基嘧啶的內(nèi)標(biāo)物。

1.2 紙基質(zhì)制備

水凝膠涂覆紙基質(zhì)制備：將色譜紙浸入60 ℃ 2%瓊脂糖水溶液中，使兩面覆蓋均勻，將紙懸掛在通風(fēng)櫥晾至表面干燥，剪成高10 mm，寬8 mm的等腰三角形，折疊成如圖1A所示形狀，備用。

常規(guī)紙噴霧紙基質(zhì)制備：將未經(jīng)修飾的色譜紙剪成高10 mm，寬8 mm的等腰三角形，備用。

1.3 紙噴霧分析

水凝膠涂覆紙噴霧裝置如圖1B所示，將制備好的水凝膠涂覆紙基質(zhì)置于質(zhì)譜口約5 mm處，滴加4 μL樣品和8 μL乙酸乙酯呈液液萃取狀態(tài)，在紙基質(zhì)表面施加3 kV直流高壓，形成噴霧，產(chǎn)生的噴霧液滴最終進(jìn)入質(zhì)譜。常規(guī)紙噴霧質(zhì)譜使用色譜紙，其他參數(shù)同水凝膠涂覆的紙噴霧質(zhì)譜。定量分析時(shí)紙噴霧質(zhì)譜方法使用4 μL樣品和15 μL甲醇。

阿米替林的質(zhì)譜定量分析使用LTQ Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientic,San Jose,CA,USA)進(jìn)行測(cè)定,其余紙噴霧質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)均使用LTQ Velos雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientic)進(jìn)行測(cè)量。所有譜圖均為正離子模式，質(zhì)譜儀毛細(xì)管入口溫度設(shè)置為275 ℃，紙噴霧所加高壓設(shè)定為3 kV。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量獲得的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)譜圖用于分析，碰撞誘導(dǎo)解離的能量設(shè)置為35%，m/z隔離寬度為2.0?？R西平m/z237.2→194.1，卡馬西平10，11-環(huán)氧化合物m/z253.0→236.1，阿替洛爾m/z267.2→190.1，普萘洛爾m/z260.2→183.1，磺胺二甲基嘧啶m/z279.2→186.0，磺胺甲基嘧啶m/z265.2→172.1，阿米替林m/z278.1→233.2，阿米替林-D6m/z286.1→233.2。離子注入時(shí)間設(shè)定為10 ms，所得信號(hào)為3次掃描的平均信號(hào)。

圖1 水凝膠涂覆紙噴霧裝置圖、簡(jiǎn)圖及噴霧圖

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠涂覆紙噴霧過(guò)程

樣品和乙酸乙酯在水凝膠涂覆的紙基質(zhì)上被固定在紙張的前半部分區(qū)域，難以向后擴(kuò)散，形成液液萃取，最終潤(rùn)濕紙張(圖1B)。水凝膠涂覆紙噴霧萃取待測(cè)物及待測(cè)物離子化過(guò)程如圖1C所示。由于水凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部富含水分子，導(dǎo)電性能好，沒(méi)有全部潤(rùn)濕的紙張仍可導(dǎo)電，并形成穩(wěn)定的噴霧。噴霧過(guò)程如圖1所示，先滴加樣品和乙酸乙酯形成液液萃取(圖1D)，接通電壓即形成噴霧(圖1E)，短暫時(shí)間后持續(xù)形成穩(wěn)定噴霧(圖1F)，直至乙酸乙酯全部消耗(圖1G)。

2.2 分析尿樣中藥物提升信號(hào)強(qiáng)度并延長(zhǎng)噴霧時(shí)間

本方法采用水凝膠涂覆紙基質(zhì)，使乙酸乙酯維持液滴形式，減少其揮發(fā)面積，以減慢揮發(fā)速度，延長(zhǎng)萃取和噴霧時(shí)間。生物流體樣品在水凝膠涂覆紙基質(zhì)的表面也呈現(xiàn)為液滴形態(tài)，與乙酸乙酯僅在表面相接觸，從而實(shí)現(xiàn)高效的液液萃取(圖1C)。因此，水凝膠涂覆紙噴霧能延長(zhǎng)噴霧時(shí)間，提升質(zhì)譜信號(hào)。為評(píng)估該方法，對(duì)比了人尿液中卡馬西平的常規(guī)紙噴霧和水凝膠涂覆紙噴霧檢測(cè)。將含有500 ng/mL卡馬西平的尿液在2種離子源中分別進(jìn)樣分析，比較MS/MS特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度和噴霧時(shí)間差異(圖2)。結(jié)果顯示，與常規(guī)紙噴霧相比，水凝膠涂覆紙噴霧信號(hào)提升100倍，噴霧時(shí)間延長(zhǎng)近10倍。使用8 μL乙酸乙酯時(shí)，與常規(guī)紙噴霧質(zhì)譜噴霧時(shí)間僅為0.12 min相比，水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜噴霧時(shí)間可達(dá)0.94 min。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為獲得水凝膠紙噴霧的最佳操作參數(shù)，實(shí)驗(yàn)以人尿液中的卡馬西平(500 ng/mL，4 μL)為樣品，對(duì)電壓、噴霧溶劑用量和種類(lèi)等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

電壓對(duì)紙噴霧質(zhì)譜的信號(hào)強(qiáng)度有較大影響，若電壓過(guò)低，不能形成噴霧或噴霧不穩(wěn)定，質(zhì)譜信號(hào)低；電壓過(guò)高，噴霧會(huì)形成cone-jet模式[24]，且易發(fā)生放電現(xiàn)象，穩(wěn)定信號(hào)時(shí)間短。考察了不同電壓(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 kV)對(duì)卡馬西平離子強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，施加2.5 kV電壓時(shí)噴霧太小，分析物信號(hào)幾乎觀察不到；施加3.0～3.5 kV電壓時(shí)信號(hào)較好；施加4.0 kV以上電壓時(shí)，會(huì)形成cone-jet模式，卡馬西平的信號(hào)降低。因此，將水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜施加電壓設(shè)定在3.0～3.5 kV。

噴霧溶劑用量也會(huì)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度產(chǎn)生較大影響。相對(duì)于樣品量，若噴霧溶劑用量太多會(huì)有顯著的稀釋效應(yīng)，待測(cè)物在萃取溶劑中的最終濃度將會(huì)嚴(yán)重降低，從而降低信號(hào)強(qiáng)度；噴霧溶劑量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致過(guò)快揮發(fā)，影響萃取時(shí)間，且揮發(fā)過(guò)快也會(huì)導(dǎo)致噴霧信號(hào)的不連續(xù)。實(shí)驗(yàn)考察了分析4 μL樣品時(shí)，乙酸乙酯用量(4、8、12、16 μL)對(duì)卡馬西平離子信號(hào)和噴霧時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，使用8 μL乙酸乙酯時(shí)，分析物信號(hào)最強(qiáng)；而乙酸乙酯用量大于8 μL時(shí)，噴霧持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。因此噴霧溶劑最佳用量選擇8 μL。

此外，還研究了萃取和噴霧溶劑的種類(lèi)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響。選取的溶劑同時(shí)作為萃取溶劑和噴霧溶劑，需綜合考慮待測(cè)物在其中的溶解度和離子化效率、溶劑揮發(fā)性等因素。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與樣品液滴和水凝膠均不互溶的多種溶劑能觀察到噴霧現(xiàn)象，質(zhì)譜信號(hào)由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、叔丁基甲醚、正丁醇、丙酮、氯仿、正己烷和甲苯，因此選擇乙酸乙酯為最佳的萃取和噴霧溶劑。

2.4 定量分析

在最佳條件下，采用本方法對(duì)人尿液中阿米替林(AMT)進(jìn)行定量分析。AMT以5、50、200、500、1 000 ng/mL的質(zhì)量濃度加入尿液，阿米替林-D6(D6-AMT)以100 ng/mL的質(zhì)量濃度作為同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物加入。將4 μL配制好的尿液滴加在水凝膠涂覆紙基質(zhì)上，再滴加8 μL乙酸乙酯形成液液萃取，施加3 kV高壓進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次。以相對(duì)強(qiáng)度(AMT/D6-AMT，y)與對(duì)應(yīng)人尿液中阿米替林質(zhì)量濃度(x,ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其線性方程為y=0.006 7x+0.148 6，r2=0.999 4。以加入內(nèi)標(biāo)的空白樣品的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算得AMT的檢出限(LOD)為0.21 ng/mL。分別采用本方法和紙噴霧質(zhì)譜方法對(duì)含有阿替洛爾、卡馬西平或磺胺二甲基嘧啶的兔全血進(jìn)行定量分析，計(jì)算得到各化合物的LOD，結(jié)果見(jiàn)表1，本方法定量分析檢測(cè)靈敏度提升了7～33倍。

表1 使用水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜分析4種藥物的檢出限及與紙噴霧質(zhì)譜的對(duì)比

2.5 水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜對(duì)生物流體中藥物的直接分析

水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物流體中藥物的直接分析。未進(jìn)行任何前處理，使用水凝膠涂覆紙噴霧質(zhì)譜在兔全血和人尿樣中直接檢測(cè)卡馬西平的結(jié)果，及其與紙噴霧質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比見(jiàn)圖2。全質(zhì)譜圖中m/z237為卡馬西平的質(zhì)子加合峰，MS/MS譜圖中m/z194為卡馬西平的特征子離子峰。

圖2 水凝膠涂覆和常規(guī)紙噴霧質(zhì)譜在生物流體中直接分析卡馬西平的譜圖

3 結(jié) 論

本研究利用水凝膠限制溶液擴(kuò)散的性質(zhì)，開(kāi)發(fā)了一種水凝膠涂覆紙噴霧離子化技術(shù)，可以有效結(jié)合液液萃取技術(shù)，實(shí)現(xiàn)生物流體樣品的高靈敏定量分析。本方法制備快速、簡(jiǎn)單可靠，能直接分析生物流體中的藥物，且能延長(zhǎng)穩(wěn)定噴霧時(shí)間，提升質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò)加入內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)全血和尿液中藥物的直接定量分析，檢出限比常規(guī)紙噴霧離子化降低7～33倍，在臨床實(shí)時(shí)檢測(cè)中具有較大潛力。