王秋穎，吳冬雪，趙幻希，李 雪，孫秀麗，修 洋*，劉淑瑩,2*

(1.長春中醫(yī)藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022)

人參皂苷是人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的主要活性成分。根據(jù)皂苷元的結構，人參皂苷被分為達瑪烷型、齊墩果酸型和奧克梯隆型。達瑪烷型皂苷的種類和含量均相對較高，是人參中最主要的一類皂苷。達瑪烷型皂苷可分為原人參二醇(Protopanaxdiol，PPD)型，如人參皂苷Rb1、Rc、Rh2等和原人參三醇(Protopanaxtriol，PPT)型，如人參皂苷Re、Rg1、三七皂苷R1等[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)的人參皂苷有100余種[3-4]，大多具有抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、免疫調節(jié)、保護中樞神經等良好的藥理活性[5-8]。研究表明，人參皂苷抗腫瘤的活性與糖基數(shù)量有關，皂苷抗腫瘤的活性隨糖基數(shù)量的減少而增加[9]。例如，稀有人參皂苷20(R)-Rg3、Rk1和Rg5具有抗癌[10-13]、增強免疫力等功效[14]。然而人參中單體皂苷含量較低，約占人參干重的4%[15]，許多具有良好藥理活性的稀有皂苷在人參中并不存在，只能通過轉化等方法獲得[16]。

人參皂苷的轉化方法可以分為化學轉化和生物轉化[17-21]。生物轉化大多采用各種酶轉化制備稀有皂苷，雖具有較高的轉化產物選擇性，但轉化時間通常較長、轉化效率較低。Wan等[22]利用曲霉中的β-半乳糖苷酶在60 ℃下連續(xù)反應60 h，將原人參二醇型皂苷轉化為稀有皂苷。然而，過長的反應時間并不利于方法的大規(guī)模應用?；瘜W轉化相比于生物轉化具有更高的轉化效率和更低的成本，是獲得稀有人參皂苷的快速而有效的方法。雜多酸是P、Si等雜原子和Mo、W等配位原子通過氧原子配位橋聯(lián)形成的一類含氧酸化合物[23-24]，相對于礦物酸具有更強的質子酸性，在催化糖苷鍵水解、水合和脫水等反應時表現(xiàn)出更高的效率和選擇性，并且便于回收利用[25-26]，是轉化中藥有效成分的良好選擇。本研究基于高效液相色譜-電噴霧-多級串聯(lián)質譜(HPLC-ESI-MSn)技術，以12-磷鎢酸(H3PW12O40·10H2O)為化學轉化試劑，系統(tǒng)研究了3種達瑪烷型皂苷(三七皂苷R1,人參皂苷Rd、20(S)-Rg3)化學轉化的產物結構和相對含量，總結了人參中達瑪烷型皂苷化學轉化的主要途徑和規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜(配備四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱)、LTQ XL線性離子阱質譜儀、Thermo Syncronis C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)(均購自Thermo Scientific公司)，水浴恒溫振蕩器(上海百典儀器設備有限公司)。

人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、Rd、三七皂苷R1對照品及12-磷鎢酸(均購自上海源葉生物科技有限公司)，色譜級甲醇、乙腈、甲酸(均購自Tedia公司)，0.22 μm的水相微孔濾膜(天津津騰科技有限公司)，超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水機(美國Merck Millipore公司)制備。其它試劑均為分析純。

1.2 方法與條件

1.2.1 人參皂苷的化學轉化反應配制1.44 mg/mL的12-磷鎢酸水溶液2 mL，置于閃點瓶中。加入2.00 mg人參皂苷標準品，充分搖勻。將閃點瓶置于80 ℃的水浴搖床連續(xù)轉化5 h，每隔30 min取出200 μL反應溶液置于1 mL容量瓶中，加水定容，過0.22 μm水相微孔濾膜后，待測。

1.2.2 色譜條件流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫：0～5 min，75%～70%A；5～8 min，70%～64%A；8～15 min，64%～52%A；15～20 min，52%～30%A；20～25 min，30%～10%A；25～28 min，10%A；28～34 min，10%～75%A。流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣量：1 μL。

1.2.3 質譜條件ESI離子源，負離子掃描模式，離子源毛細管溫度：325 ℃，鞘氣：241 kPa，輔助氣：3 300 mL/min，吹掃氣：1 000 mL/min，毛細管電壓：-2 500 V。質譜采用全掃描和多級串聯(lián)模式，兩模式的質量范圍分別為m/z100～2 000和m/z200～1 200。

1.3 碎片離子命名規(guī)則

采用Costello規(guī)則命名人參皂苷糖苷鍵斷裂產生的碎片離子[27]。以Y、Z分別表示氧原子是、否保留在還原端，0、1分別表示糖基鏈自還原端起的第1個糖苷鍵和第2個糖苷鍵，α、β分別表示C20位糖基鏈和C3位(PPD型)或C6位(PPT型)糖基鏈，符號′和″分別表示另1條糖基鏈自還原端起的第1個糖苷鍵和第2個糖苷鍵。

圖1 三七皂苷R1化學轉化5 h產物的總離子流圖

2 結果與討論

2.1 PPT型皂苷R1的轉化產物結構分析

利用HPLC-ESI-MSn對原人參三醇型皂苷R1的轉化產物進行分離和分析，總離子流圖如圖1所示，共有9種轉化產物，依次命名為峰1～9。

圖1中峰1和2的基峰為m/z833.53，說明它們是1對同分異構體。對峰1和峰2的基峰進行串聯(lián)質譜分析，得到m/z787.53的碎片離子。在負離子掃描模式下，人參皂苷易于結合甲酸根形成[M+HCOO]-離子，在串聯(lián)質譜分析中脫除46 Da的甲酸形成[M-H]-離子。由此可以推斷峰1和2的相對分子質量為788.53。進一步對[M-H]-離子進行二級串聯(lián)質譜分析，結果如圖2所示。

圖2中觀察到Y1β和Y0β兩個主要碎片離子。Y1β離子與母離子有-132 Da的質量差異，是由母離子丟失1分子木糖所形成。Y0β離子則是由Y1β離子丟失1分子葡萄糖(162 Da)所形成，表明峰1和2的結構中存在1分子葡萄糖和1分子木糖，對應于反應物R1中C6位的糖基取代基結構。與原人參三醇型皂苷元的特征碎片離子m/z475.53相比，Y0β離子有+18.06 Da的質量差異，說明產物1和2是反應物R1脫除C20位糖基取代基后，在C24、C25位發(fā)生水合反應后的產物，由人參皂苷元的結構可以推斷，水合反應遵循Markovnikov規(guī)則，即羥基加成在氫原子較少的C25位[28-29]。在C20位的手性碳原子產生的人參皂苷差向異構體中，20(S)型異構體的極性大于20(R)型，在C18反相色譜柱中先出峰。因此確定峰1和2分別為人參皂苷20(S)-25-OH-R2和20(R)-25-OH-R2。

圖2 人參皂苷20(S)-25-OH-R2的[M-H]-離子m/z 787.53的二級串聯(lián)質譜圖

峰3的相對分子質量為770.53，對其[M-H]-離子進行串聯(lián)質譜分析，結果如圖3所示。兩個主要碎片離子Y1β和Y0β分別由母離子丟失1分子木糖(132 Da)和Y1β離子丟失1分子葡萄糖(162 Da)所形成。在圖3中還觀察到m/z417.51離子，通過對Y0β離子進行三級串聯(lián)質譜分析發(fā)現(xiàn)，m/z417.51是Y0β的子離子。兩個離子的質量差異為58.02 Da，對應于連接了2個甲基的叔醇結構(C3H6O)，由此推斷m/z417.51是由Y0β丟失了C25位的叔醇結構所產生，說明峰3與峰1和2均發(fā)生了C24-C25位的水合反應。然而，峰3皂苷元離子的質荷比仍為475.53，說明其在C20位的羥基發(fā)生脫水反應(-18 Da)，彌補了水合反應導致的質量增加，因此可推斷峰3為人參皂苷25-OH-T5。

圖3 人參皂苷25-OH-T5的[M-H]-離子m/z 769.53的二級串聯(lián)質譜圖

峰4、5、6、7是相對分子質量為770.53的同分異構體，與反應物R1的相對分子質量932.53相差162 Da。結合峰4和5的[M-H]-離子的串聯(lián)質譜圖(如圖4)，由Y1β和Y0β離子可以推斷峰4、5、6、7是由反應物R1脫除C20位的葡萄糖取代基的產物。根據(jù)這4種產物的保留時間，推斷峰4和5、峰6和7具有相似的皂苷元結構。圖4中除了Y0β和Y1β離子之外，還有碎片離子m/z391.38。通過對Y0β離子進行三級串聯(lián)質譜分析發(fā)現(xiàn)，m/z391.38離子是由Y0β離子中性丟失84.18 Da所產生。84.18 Da對應于皂苷元離子C20位的烯烴鏈(C6H12)，因此可以推斷皂苷元離子丟失C20位烯烴鏈產生m/z391.38的特征碎片離子，由此證明峰4和5的C24-C25位未發(fā)生水合反應，僅為反應物R1丟失1分子葡萄糖所形成的產物。因此將峰4和5分別歸屬為人參皂苷20(S)-R2和20(R)-R2。

圖4 人參皂苷20(S)-R2的[M-H]-離子m/z 769.53的二級串聯(lián)質譜圖

在峰6和峰7的[M-H]-離子的串聯(lián)質譜圖(圖5)中，除了Y0β和Y1β離子，同時出現(xiàn)了m/z391.38和m/z417.39離子。說明峰6和7的皂苷元離子可以同時產生58.01 Da和84.15 Da的中性丟失。由此推斷峰6和7的皂苷元發(fā)生了環(huán)合反應，即C20位羥基與C24-C25位雙鍵加成，形成含氧6元環(huán)結構。m/z391.38對應于C20-C22和C25位C—O鍵斷裂產生的碎片離子；m/z417.39對應于C24-C25和C20位C—O鍵斷裂產生的碎片離子?？梢钥闯?，在發(fā)生環(huán)合反應后，C20仍具有手性，即峰6和7為差向異構體。因此將峰6和7分別歸屬為人參皂苷20(S)-25-epoxy-R2和20(R)-25-epoxy-R2。

圖5 人參皂苷20(S)-25-epoxy-R2的[M-H]-離子m/z 769.56的二級串聯(lián)質譜圖

峰8和9的相對分子質量為752.53，對其[M-H]-離子m/z751.56進行串聯(lián)質譜分析可得到Y1β離子和Y0β離子，結果如圖6所示。Y1β離子與母離子有-132.01 Da的質量差異，是由母離子丟失1分子木糖所形成。Y0β離子則是由Y1β離子丟失1分子葡萄糖(162.02 Da)所形成。Y0β離子與反應物R1皂苷元離子m/z475.53相差-18 Da，可以推斷在C20位發(fā)生糖苷鍵斷裂后又發(fā)生了脫水反應。因此將峰8和9分別歸屬為T5和3β，12β-二羥基-6α-(2-O-β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖氧基)達瑪烷-20(22)，24-二烯。

圖6 人參皂苷T5的[M-H]-離子m/z 751.56的二級串聯(lián)質譜圖

圖7 人參皂苷Rd化學轉化5 h產物的總離子流圖

2.2 PPD型人參皂苷的轉化

Rd經過轉化獲得10種不同產物，總離子流圖如圖7所示。峰1和2的質譜圖基峰為m/z847.55，對峰1和2的基峰離子進行串聯(lián)質譜分析，得到m/z801.55的碎片離子。進一步對[M-H]-離子進行串聯(lián)質譜分析(圖8)，可以觀察到2個主要碎片離子Y1β、Y0β，分別是母離子丟失1分子葡萄糖(162.02 Da)和2分子葡萄糖(324.02 Da)的產物，說明峰1和2的結構中存在2分子葡萄糖取代基。在串聯(lián)質譜圖中還觀察到碎片離子m/z419.51。通過對Y0β離子進行三級串聯(lián)質譜分析發(fā)現(xiàn)，m/z419.51是Y0β的子離子。2個離子的質量差異為58.02 Da，對應于連接了2個甲基的叔醇結構(C3H6O)，由此推斷m/z419.51離子是由Y0β離子丟失了C25位的叔醇結構所產生。另一方面，Y0β離子與原人參二醇型皂苷元的特征結構m/z459.53相比有+18 Da的質量差異，推斷峰1和2是反應物Rd脫除C20位糖基取代后，在C24、C25位發(fā)生水合作用后的轉化產物，因此可判斷峰1和2分別為人參皂苷20(S)-25-OH-Rg3和20(R)-25-OH-Rg3。

圖8 人參皂苷20(S)-25-OH-Rg3的[M-H]-離子m/z 801.55的二級串聯(lián)質譜圖

圖9 人參皂苷25-OH-Rk1(A)、20(S)-Rg3(B)和20(S)-25-epoxy-Rg3(C)的[M-H]-離子m/z 783.55的二級串聯(lián)質譜圖

峰3～8的相對分子質量均為784.55，與Rd的相對分子質量相差162 Da，結合峰3～8的[M-H]-離子的串聯(lián)質譜圖(圖9)，由Y1β和Y0β可以推斷峰3～8是由反應物Rd在C20位發(fā)生糖苷鍵斷裂后所生成的6個同分異構體。6種產物的保留時間相近，可以推斷峰3和4、峰5和6、峰7和8具有相似的皂苷元結構。圖9A中除了Y1β和Y0β離子之外，出現(xiàn)了特征碎片離子m/z401.34。三級串聯(lián)質譜分析表明m/z401.34是Y0β中性丟失58.11 Da產生，由此推斷峰3和4在C24-C25位發(fā)生水合反應。但皂苷元離子的質荷比仍為459.45，說明其在C20位的羥基還發(fā)生了脫水反應(-18 Da)。因此推斷峰3和4分別為人參皂苷25-OH-Rk1和25-OH-Rg5。通過比對標準品可以確定，峰5和6分別為人參皂苷20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。對峰7和8的[M-H]-離子進行串聯(lián)質譜分析(圖9C)，同時出現(xiàn)了m/z375.41和m/z401.42離子，即峰7和8的皂苷元離子可以同時產生58.01 Da和84.02 Da的中性丟失，由此推斷峰7和8的皂苷元發(fā)生了環(huán)合反應，確定峰7和8分別為人參皂苷20(S，25)-epoxy-Rg3和20(R，25)-epoxy-Rg3。

如圖10所示，峰9和10的相對分子質量為766.55，對其[M-H]-離子m/z765.55進行串聯(lián)質譜分析可得到Y1β和Y0β離子,Y0β與反應物Rd皂苷元離子m/z459.53相差-18.02 Da，由此推測峰9和10為Rd在C20位發(fā)生去糖基化反應后進一步發(fā)生脫水反應的產物，經標準品比對確定其分別為Rk1和Rg5。

利用相同的反應條件對20(S)-Rg3進行轉化，得到10種與Rd相同的產物，即20(S)-25-OH-Rg3、20(R)-25-OH-Rg3、25-OH-Rk1、25-OH-Rg5、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、(20S,25)-epoxy-Rg3、(20R,25)-epoxy-Rg3、Rk1和Rg5。

圖10 人參皂苷Rk1的[M-H]-離子m/z 765.55的二級串聯(lián)質譜圖

圖11 人參皂苷20(S)-Rg3和Rd轉化的20(S)-25-OH-Rg3的峰面積

2.3 Rd和20(S)-Rg3化學轉化產物的相對含量分析

采用HPLC-ESI-MSn質譜的選擇離子掃描(SIM)模式對Rd和20(S)-Rg3的轉化產物20(S)-25-OH-Rg3進行相對定量分析，產物的峰面積隨反應時間的變化結果如圖11所示。結果顯示，在相同的反應條件下20(S)-Rg3轉化得到的20(S)-25-OH-Rg3相對含量在各時間點均明顯高于Rd，這是由于Rd轉化為20(S)-25-OH-Rg3需先脫除C20位的葡萄糖取代基，與20(S)-Rg3相比反應更復雜，并且需要更高的反應能量。20(S)-25-OH-Rg3的相對含量在反應初始階段逐漸升高，當達到一定濃度后又開始降低，這是因為20(S)-25-OH-Rg3可通過C20位的水合反應進一步生成轉化產物25-OH-Rk1和25-OH-Rg5，直至達到反應平衡。由此可知，人參皂苷的多種化學轉化途徑中包含可逆反應，轉化產物之間也可以發(fā)生互相轉化。

進一步比較了20(S)-Rg3的轉化產物R型與S型25-OH-Rg3在0～4 h內相對含量的變化規(guī)律，結果表明在轉化初期的0.5 h內，只有S型產物生成，隨后R型產物的相對含量逐漸增加。S型產物的含量在各時間點均明顯高于R型，這是因為反應初始階段20(S)-Rg3首先發(fā)生差向異構化反應生成20(R)-Rg3，隨后20(R)-Rg3在C25位發(fā)生水合反應生成20(R)-25-OH-Rg3，而反應物20(S)-Rg3只需發(fā)生一步水合反應即可生成20(S)-25-OH-Rg3。

進一步考察了Rd轉化產物20(S)-Rg3的相對含量隨反應時間的變化趨勢，結果顯示，反應開始后0.5 h時20(S)-Rg3的相對含量達到最高，此后隨反應時間的增加而逐漸下降，說明20(S)-Rg3是Rd其他轉化產物的中間產物，由它生成其他多種稀有皂苷。由此證明，人參皂苷在化學轉化時首先發(fā)生C20位脫糖的去糖基化反應，然后進行水合、脫水和環(huán)合等反應過程。

3 結 論

利用HPLC-ESI-MSn技術研究了3種達瑪烷型人參皂苷在酸性環(huán)境下化學轉化產物的結構和轉化途徑，多級串聯(lián)質譜分析結果顯示三七皂苷R1轉化得到9種產物：20(S)-25-OH-R2、20(R)-25-OH-R2、25-OH-T5、20(S)-R2、20(R)-R2、20(S)-25-epoxy-R2、20(R)-25-epoxy-R2、T5、3β，12β-二羥基-6α-(2-O-β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖氧基)達瑪烷-20(22)，24-二烯；Rd和20(S)-Rg3轉化得到10種產物：20(S)-25-OH-Rg3、20(R)-25-OH-Rg3、25-OH-Rk1、25-OH-Rg5、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、(20S,25)-epoxy-Rg3、(20R,25)-epoxy-Rg3、Rk1、Rg5。通過分析轉化產物的相對含量，發(fā)現(xiàn)化學轉化過程中首先發(fā)生C20位去糖基化反應，由去糖基化產物繼續(xù)轉化為其它產物，其它產物之間通過可逆反應相互轉化，直至反應平衡。通過總結轉化產物的結構特征，獲得達瑪烷型皂苷化學轉化所發(fā)生的主要反應歷程：①去糖基化反應：優(yōu)先脫除C20位的糖基取代基；②差向異構化反應：由去糖基化后C20位手性碳原子的2種構型所形成；③水合反應：C24和C25位雙鍵加成1個水分子，羥基加成在C25位；④脫水反應：C20的羥基與C21或C22位β氫原子發(fā)生清除反應，生成Δ20(21)和Δ20(22)的同分異構體；⑤環(huán)合反應：C20位羥基與C24和C25位雙鍵加成，形成含氧六元環(huán)結構。此外，還觀察到一些特征中性丟失，即皂苷元離子C24和C25斷裂產生58 Da以及在C20和C22位斷裂產生的84 Da，它們分別代表皂苷元的烯烴鏈發(fā)生了水合反應和烯烴鏈結構未發(fā)生變化。當2種中性丟失同時發(fā)生時，可以推斷達瑪烷型皂苷發(fā)生了環(huán)合反應。以上結果表明，磷鎢酸產生的酸性環(huán)境可以有效地將達瑪烷型皂苷轉化為稀有皂苷，并且HPLC-ESI-MSn是皂苷轉化產物結構和途徑分析的有效方法。