吳惠勤，黃 芳，黃曉蘭，羅輝泰，謝淑桐，周 熙

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

沉香由瑞香科植物白木香樹產(chǎn)生，主產(chǎn)地在中國南方及東南亞，是一種珍貴的中藥材[1]?，F(xiàn)代研究表明，沉香在治療消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及外科、婦科、兒科、五官科和皮膚科疾病等方面均有顯著療效，在抗腫瘤、抗風濕病以及美容等方面亦有較好的作用[2-5]?？梢?，沉香的藥理作用和臨床應(yīng)用范圍十分廣泛，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

有研究表明沉香中的特征性成分主要由倍半萜類揮發(fā)性成分(占52%)和2-(2-苯乙基)色酮類難揮發(fā)性成分(占41%)[6]組成。沉香的氣味主要由揮發(fā)性成分構(gòu)成，通常采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法進行成分研究[7-9]。吳惠勤等[10-12]采用固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜(SPME/GC-MS)測定了沉香的香氣成分，基本闡明了揮發(fā)性的化學(xué)成分。對于難揮發(fā)性成分的研究，主要采用液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜法[13-14]，楊錦玲等[15]測定了不同結(jié)香方法所得沉香的色酮含量，發(fā)現(xiàn)其含量差異大。有學(xué)者研究沉香的液相色譜指紋圖[16-18]，發(fā)現(xiàn)藥材產(chǎn)地、結(jié)香方法和時間均可導(dǎo)致成分差異和質(zhì)量差異?，F(xiàn)行《中國藥典》[19]規(guī)定沉香的定量指標為沉香四醇，另外規(guī)定沉香的特征液相色譜圖中須含有6個特征峰，其中1、3、5號峰給出了化合物名稱，其余均為未知化學(xué)成分。中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是化學(xué)成分，目前沉香中有很多難揮發(fā)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不清楚，給中藥的質(zhì)量評價和質(zhì)量控制帶來困難，影響中藥的現(xiàn)代化進程。為研究沉香中這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，本研究采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-Q-TOF-MS)法測定其組成，同時采集色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，得到高分辨飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)總離子流色譜圖和液相色譜-紫外檢測圖(HPLC-UV)，用Qualitative Navigator B.08.00軟件識別總離子流色譜圖中各色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)(精確至小數(shù)點后第四位)，并標注在色譜峰上，即得到每個色譜峰具有唯一性的數(shù)字化信息。進一步通過計算機軟件推算出每個精確質(zhì)量數(shù)的元素組成(分子式)，結(jié)合二級質(zhì)譜子離子的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及文獻報道推斷出化學(xué)結(jié)構(gòu)，從沉香中共鑒定了30個難揮發(fā)性成分，達到以數(shù)字化形式表征化學(xué)成分的目的。本文首次提出并構(gòu)建了沉香的數(shù)字化的HPLC-UV/TOF-MS指紋圖，對色譜圖中每種化學(xué)成分給出了類似于身份證的數(shù)字化信息，具有唯一性，且主要成分均鑒定出化學(xué)結(jié)構(gòu)，全面地表征了沉香的物質(zhì)組成。本研究為沉香的質(zhì)量綜合評價提供了可行方法，也為藥理、藥效研究及質(zhì)量標準研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 HPLC-6540-Q-TOF-MS配有雙噴射流電噴霧離子源(美國安捷倫公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；KQ2200型臺式機械超聲波清洗器(東莞市超聲波設(shè)備有限公司)；甲醇、乙醇、乙腈(HPLC級，德國Merck公司)，實驗用水為二次蒸餾水，甲酸(阿拉丁試劑有限公司)。沉香四醇對照品(批號19020131)、沉香對照藥材(批號121222-201203)均購于中國食品藥品檢定研究院;沉香樣品由江門粵怡沉香科技公司提供。

1.2 實驗方法

將沉香藥材粉碎，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL乙醇，稱定質(zhì)量，浸泡0.5 h，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz ) 1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用乙醇補足損失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液過濾，濾液待上機分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18(25 cm×4.6 mm×5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B。梯度洗脫程序：0～10 min，15%～20%A；10～19 min，20%～23%A；19～21 min，23%～33%A；21～39 min，33%A；39～40 min，33%～35%A；40～50 min，35%A；50.1～60 min，95%A；60～66 min，95%～15%A。流速為0.7 mL/min，紫外檢測波長為252 nm。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為Agilent雙噴Jet Stream源(Dual Jet Stream ESI)，正離子模式采集，干燥氣(N2)溫度：350 ℃，霧化氣(N2)壓力：275.8 kPa，流速：8 L/min，鞘氣溫度：350 ℃，流速：11 L/min，毛細管電壓：3 000 V，毛細管出口電壓(Fragmentor)：110 V，錐孔電壓(Skimmer)：65 V，八極桿電壓：750 V，采集模式為自動MS/MS，掃描范圍：m/z80～1 100 u；參比離子：m/z121.050 9、922.009 8。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

沉香在正離子模式掃描過程中各成分均形成[M+H]+的準分子離子峰，二級質(zhì)譜碎裂生成子離子；負離子模式掃描過程中各成分丟失質(zhì)子形成[M-H]-的準分子離子峰，但響應(yīng)值比正離子模式低，因此本實驗采用正離子掃描模式進行檢測。

2.2 紫外色譜圖及總離子流圖的測定

沉香的前處理方法和液相色譜條件參照《中國藥典》2015版[19]沉香項下，采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，同時采集紫外檢測數(shù)據(jù)，樣品的高分辨質(zhì)譜總離子流(TIC)圖見圖1。與紫外色譜圖(圖略)相比，相同保留時間色譜峰的豐度有較明顯差異，UV圖中部分峰明顯偏低，主要是由于檢測機理不同使得響應(yīng)強弱不同所致。

圖1 沉香的質(zhì)譜總離子流圖

2.3 精確質(zhì)量數(shù)的識別及數(shù)字化指紋圖的建立

經(jīng)高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀測得沉香的總離子流質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對圖1中各色譜峰進行精確質(zhì)量數(shù)識別，以該色譜峰豐度最高的質(zhì)譜峰所對應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)為該峰的準分子離子峰(母離子)，每個母離子均為[M+H]+離子，因此以該準分子離子的精確質(zhì)量數(shù)表示該色譜峰的質(zhì)量數(shù)(精確到小數(shù)點第4位)，識別出TIC圖中30個色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)。由于UV圖及TIC圖中保留時間相同的峰為同一物質(zhì)，因此可將精確質(zhì)量數(shù)標注在UV圖上，然后確定各精確質(zhì)量數(shù)的分子式，并進一步鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而得到數(shù)字化的色譜-質(zhì)譜指紋圖(見圖2及圖3)，可表征沉香的化學(xué)成分。

圖2 沉香的HPLC-TOF-MS數(shù)字化指紋圖譜

圖3 沉香的HPLC-UV數(shù)字化指紋圖譜

圖4 2-(2-苯乙基)色酮類成分的裂解途徑

2.4 數(shù)字化指紋圖中成分鑒定

進一步分析“2.3”的沉香色譜-質(zhì)譜指紋圖，利用儀器定性分析軟件對各峰對應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)進行分析，推測出最有可能的分子式并確定離子的狀態(tài)，然后逐個研究其二級質(zhì)譜的碎片離子、丟失基團、質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷化合物的可能結(jié)構(gòu)式，用對照品進行質(zhì)譜測定，確證各個成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。最終，從沉香中共鑒定出30個化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

研究結(jié)果顯示，沉香的主要成分為2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)，通過對該類化合物的裂解機理進行研究，發(fā)現(xiàn)其母核結(jié)構(gòu)的裂解規(guī)律(見圖4)。以下對5、18、28號色譜峰進行了詳細的質(zhì)譜解析。

5號峰(保留時間18.49 min)的一級質(zhì)譜圖見圖5A，準分子離子峰[M+H]+的精確質(zhì)量數(shù)為319.118 2，推斷其分子式為C17H18O6，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)；[M+H]+319.118 2的二級質(zhì)譜圖見圖5B，其主要生成碎片離子：m/z301.107 1、283.096 8、255.101 8、227.106 4、192.041 8、164.046 6、105.069 6、91.054 1等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為：準分子離子峰m/z319.118 2中的氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發(fā)生斷裂，中性丟失1分子H2O ，形成m/z301.107 1[M+H-H2O]+碎片離子，然后另1個氫重排到另1個羥基上，氧原子上的1個鍵發(fā)生斷裂，再中性丟失1分子H2O形成m/z283.096 8[M+H-2H2O]+碎片離子；m/z283.096 8先發(fā)生i誘導(dǎo)斷裂，然后發(fā)生α斷裂，中性丟失1分子CO，形成m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+碎片離子；準分子離子m/z319.118 2環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另一個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z227.106 4和m/z91.054 1的碎片離子。m/z227.106 4氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發(fā)生斷裂，中性丟失2分子 H2O，形成m/z192.041 8的碎片離子。m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另一個鍵斷裂(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6和m/z105.069 6的碎片離子。綜合以上信息推斷5號峰(分子量為318)的化學(xué)成分為沉香四醇，精確分子量為318.110 3，分子式為C17H18O6，其裂解機理見圖6。

圖5 5號峰的一級質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)319.118 2峰的二級質(zhì)譜圖(B)

圖6 沉香四醇的裂解機理

18號峰(保留時間為31.95 min)的一級質(zhì)譜圖見圖7A，準分子離子峰[M+H]+的精確質(zhì)量數(shù)為337.083 2，推測其分子式為C17H17ClO5，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)；[M+H]+337.083 2的二級質(zhì)譜圖見圖7B，其主要生成碎片離子：m/z319.073 4、301.062 4、283.096 2、265.085 4、192.041 2、91.053 6等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為：準分子離子峰m/z337∶m/z339 的豐度比約3∶1，可見分子中含有1個氯原子，準分子離子m/z337.083 2環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z319.073 4和m/z91.053 6的碎片離子。準分子離子m/z337.083 2氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發(fā)生斷裂，中性丟失1分子 H2O，形成m/z319.073 4 [M+H-H2O]+碎片離子，隨后另1個氫重排到另1個羥基上，氧原子上的1個鍵發(fā)生斷裂，又中性丟失1分子 H2O，形成m/z301.062 4[M+H-2H2O]+碎片離子；m/z319.073 4氫重排到氯原子上，氯原子上1個鍵發(fā)生斷裂，中性丟失1分子HCl，形成m/z283.096 2[M+H-H2O-HCl]+碎片離子;m/z301.062 4氫重排到氯原子上，氯原子上1個鍵發(fā)生斷裂，中性丟失1分子HCl，形成m/z265.085 4[M+H-2H2O-HCl]+碎片離子；碎片離子m/z283.096 2環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(二環(huán)之間的CH2-CH2鍵發(fā)生斷裂)，形成m/z192.041 2、91.053 6的碎片離子。綜合以上信息并結(jié)合文獻分析，推斷該成分為8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羥基-5，6，7，8-四氫色酮，其裂解機理見圖8。

28號峰(保留時間為46.17 min)的一級質(zhì)譜圖見圖9A，準分子離子峰[M+H]+的精確質(zhì)量數(shù)為283.095 9，推測分子式為C17H14O4，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)；[M+H]+283.095 9的二級質(zhì)譜圖見圖9B，其主要生成碎片離子：m/z255.100 6、227.106 1、192.041 3、164.046 6、123.041 7、105.069 2、91.053 7。質(zhì)譜裂解規(guī)律為：準分子離子m/z283.095 9環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z192.041 3和m/z91.053 7的碎片離子；準分子離子m/z283.095 9先發(fā)生i誘導(dǎo)斷裂，然后發(fā)生α斷裂，中性丟失1分子CO，形成m/z255.100 6[M+H-CO]+碎片離子，再發(fā)生i誘導(dǎo)斷裂，隨后發(fā)生α斷裂，又失去1分子CO，形成m/z227.106 1[M+H-2CO]+碎片離子；m/z227.106 1[M+H-2CO]+的 CH2-CH2鍵發(fā)生α斷裂，形成m/z123.041 7和m/z105.069 2的碎片離子；m/z255.100 6[M+H-CO]+環(huán)上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6的碎片離子。綜合以上信息并結(jié)合文獻分析，推測該成分為6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮，其裂解機理見圖10。

圖7 18號峰的一級質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)337.083 2峰的二級質(zhì)譜圖(B)

圖8 8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羥基-5，6，7，8-四氫色酮的裂解機理

Fig.8 Pyrolysis mechanism of 8-chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone

圖9 28號峰的一級質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)283.095 9峰的二級質(zhì)譜圖(B)

圖10 6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮的裂解機理

表1 沉香指紋峰的精確質(zhì)量數(shù)及其化學(xué)成分

(續(xù)表1)

PeakNo.Retentiontime(min)Accuratemassnumber(m/z)Fragmentions(m/z)StructuralformulaCompoundRelativecontent(%)1831.95337.0832319.0734,301.0624,265.0854,91.0536C17H17ClO58-Chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮)1.611932.93313.1068207.0641,107.0480C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構(gòu)體)0.202034.41331.1169313.1076,285.1121,121.0647,91.0539C18H18O65,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-[2-(4-methoxybenzene)ethyl]chromoneorisomer(5,6-環(huán)氧-7,8-二羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮或異構(gòu)體)1.082135.28301.1063283.0859,255.1009,164.0462,91.0539C17H16O55,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(5,6-環(huán)氧-7,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮)8.712236.78237.1842219.1732,163.1105,91.0531C14H20O35,6,6-Trimethyl-5-(3-oxobutyl-1-ene)-1-oxazolo[2.5]octane-4-one(5,6,6-三甲基-5-(3-氧代丁基-1-烯基)-1-氧雜螺[2.5]辛-4-酮)0.342337.53313.1067177.0542,137.0591C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構(gòu)體)0.242439.86313.1077137.0605,122.0356C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構(gòu)體)0.172542.24313.1061163.0386,121.0566,91.0541C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構(gòu)體)0.322643.71283.0965255.0994,227.1049,91.0536C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneiso-mer(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮異構(gòu)體)0.752745.23313.1067163.0387,121.0644C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮)14.112846.17283.0959164.0466,91.0537C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮)29.242947.93313.1067121.0542,91.0476C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromoneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構(gòu)體)0.353049.78283.0959192.0417,153.0181,126.0310,91.0540C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneisomer(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮異構(gòu)體)0.51

表2 沉香6個特征峰的化學(xué)成分

圖11 沉香的特征色譜圖

2.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)驗證

為驗證“2.4”中所鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)的可靠性，在相同條件下測定色譜保留時間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，若該成分與其對照品的保留時間及準分子離子峰、二級特征離子完全一致，則可判定為該化合物。如鑒定出質(zhì)量數(shù)319.118 2為沉香四醇，以標準品作對照，相同條件下測定沉香四醇對照品的色譜保留時間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，沉香四醇對照品及沉香樣品的保留時間均為12.88 min，且沉香四醇對照品的二級質(zhì)譜圖與圖5B中的質(zhì)譜離子完全相同，證明該峰為沉香四醇，結(jié)果可靠。

2.6 2015版《中國藥典》沉香項下指定特征成分的鑒定

2015版《中國藥典》沉香項下指定特征圖譜(見圖11)中的6個特征峰，只明確了第1、3、5號峰的化學(xué)名稱，與本文的數(shù)字化指紋圖譜進行對比(見圖3)，結(jié)果顯示此3個成分與鑒定一致；另3個峰的鑒定結(jié)果見表2，可為藥典標準的提升提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

3 結(jié) 論

本文首次采用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)研究建立了沉香的色譜-質(zhì)譜數(shù)字化指紋圖譜。沉香色譜圖中的每個峰均給出了精確質(zhì)量數(shù)及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并鑒定了其中30個成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括《中國藥典》沉香項下特征圖譜中的未知成分。本方法系統(tǒng)鑒定了沉香中難揮發(fā)物質(zhì)的化學(xué)成分，所構(gòu)建的色譜-質(zhì)譜數(shù)字化指紋圖譜能全面反映沉香的物質(zhì)成分，為沉香的藥理、藥效和質(zhì)量標準研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。