黃 靜，李惠琳,2*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東省手性分子與藥物發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

蛋白質(zhì)(Protein)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)控生命體內(nèi)幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程[1-2]。蛋白質(zhì)在一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的基礎(chǔ)上折疊、盤曲成特定的空間結(jié)構(gòu)而具有功能[3]，其功能受結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化[4-5]、配體(如小分子、蛋白質(zhì)或DNA等)相互作用及翻譯后修飾(Post translational modifications,PTMs)的調(diào)節(jié)[6]。因此，對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的深入研究不僅有助于揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)，更與人類健康息息相關(guān)，并將極大地促進(jìn)藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)。

在過(guò)去的40年中，結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段如X-射線晶體學(xué)(X-ray crystallography)[7]、核磁共振(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)[8]、冷凍電鏡(Electron cryomicroscopy,cryoEM)[9]、中子晶體衍射(Neutron diffraction)[10]和小角衍射(Small-angle scattering,SAS)[11]等技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理解。不同的生物物理學(xué)方法各有優(yōu)勢(shì)和局限性。X-射線晶體學(xué)可以提供高分辨率(原子水平)的結(jié)構(gòu)信息，但大分子量的蛋白復(fù)合物往往難以結(jié)晶。NMR能夠在更接近于生理狀態(tài)下獲得蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息，但目前更多局限于分子量較小(<～50 kDa)的蛋白樣品，且對(duì)蛋白質(zhì)樣品濃度要求較高。近年來(lái)，cryoEM技術(shù)的迅猛發(fā)展極大地拓展了人們對(duì)大蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的認(rèn)知，并且所需樣品量少，可以獲得較高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，但其分辨率往往受到樣品異質(zhì)性和分子量大小的影響。全面解析蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能通常需要結(jié)合多種技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，互補(bǔ)技術(shù)的不斷發(fā)展對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)分析也起到了越來(lái)越重要的作用。

除了傳統(tǒng)的生物物理學(xué)方法，質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)領(lǐng)域的研究。1980年代末，軟電離技術(shù)如基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)的發(fā)明推動(dòng)了生物質(zhì)譜的飛速發(fā)展，使得生物大分子能夠以完整離子的形式被轉(zhuǎn)移到氣相中，從而被不同類型的質(zhì)量分析器所檢測(cè)[12]。質(zhì)譜分析不僅可用于鑒定蛋白序列和翻譯后修飾[13]，還能用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、折疊和動(dòng)力學(xué)機(jī)制[14-16]。其中，氫氘交換質(zhì)譜(Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的一種強(qiáng)有力工具，也是對(duì)傳統(tǒng)生物物理手段的重要補(bǔ)充[17]。氫氘交換(HDX)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)早已不是一個(gè)新的概念。Linderstr?m-Lang在1954年的工作中首次將蛋白質(zhì)置于D2O中，利用密度梯度管測(cè)定氫氘交換速率從而研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[18]，并由此奠定了HDX的理論基礎(chǔ)[19]。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)可通過(guò)結(jié)合低溫超高壓高效液相色譜和質(zhì)譜儀器分析確定酰胺氫氘交換的位置和速率。此外，實(shí)驗(yàn)分析流程和前期數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化使得HDX-MS技術(shù)發(fā)展迅速，成為一種有效的蛋白結(jié)構(gòu)分析工具[20]。雖然HDX-MS不能獲得高分辨率的蛋白結(jié)構(gòu)信息，但其優(yōu)點(diǎn)在于基本不受分析體系的大小和復(fù)雜程度的限制[21]，樣品需求量少，并且還可用于研究對(duì)于傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)學(xué)分析方法具有挑戰(zhàn)的蛋白體系，如膜蛋白[22]、無(wú)序蛋白[23]和超大蛋白復(fù)合物[24]。本文首先介紹了HDX-MS的基本原理、交換機(jī)制、實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)研究進(jìn)展，隨后從蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用3個(gè)方面對(duì)HDX-MS的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

圖1 骨架酰胺H(綠色)、側(cè)鏈H(藍(lán)色)和碳原子相連的H(黃色)

1 氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)概述

1.1 基本原理

HDX技術(shù)利用蛋白質(zhì)中不穩(wěn)定的氫原子可以與溶液中的氘原子發(fā)生交換的化學(xué)反應(yīng)特性研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[19]，不同類型的氫原子H/D交換速率不同(圖1)。例如，C—H鍵幾乎不發(fā)生溶劑介導(dǎo)的交換；蛋白質(zhì)N端和氨基酸側(cè)鏈 (—OH,—SH,—NH)的H/D交換速率快，半衰期短(0.01～1 ms)，并且交換上去的氘原子在分析后期很容易被溶液中的氫原子交換下來(lái)(回交，Back exchange)，很難通過(guò)質(zhì)譜方法檢測(cè)[25]；而骨架酰胺H/D交換速率相對(duì)緩慢，可以利用MS通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量變化來(lái)監(jiān)測(cè)交換反應(yīng)。蛋白質(zhì)的每個(gè)氨基酸(脯氨酸除外)都存在一個(gè)骨架酰胺氫，因此，骨架酰胺的H/D交換水平反映了蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。通過(guò)比較蛋白質(zhì)在不同狀態(tài)下氘代水平的變化，可以獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化的信息。然而，主鏈酰胺氫交換速率受氫鍵、溶劑性質(zhì)(pH值、溫度)以及蛋白質(zhì)構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的影響，可以發(fā)生顯著變化[25-27]。

1.1.1 pH值氫氘交換是一類酸堿催化反應(yīng)[28]，酰胺氫的交換速率(kch)符合公式:

kch=kint,acid[H3O+]+kint,base[OH-]+kint,water[H2O]

(1)

其中，kint,acid和kint,base分別代表酸催化和堿催化的速率系數(shù)，kint,water則表示水催化質(zhì)子轉(zhuǎn)移的固有系數(shù)[28-29]。由公式(1)可知，酰胺氫交換速率高度依賴于環(huán)境pH值的變化。pH值低于2.5～3.0時(shí)，酸催化為主導(dǎo)；當(dāng)pH值大于3.0時(shí)，質(zhì)子轉(zhuǎn)移主要受堿催化反應(yīng)控制[30-31]。pH值位于2.5～3.0之間時(shí)，交換速率最小(約比pH 7.0時(shí)低105倍)，稱為pHmin。值得注意的是，生理環(huán)境下(pH 7.0～7.4)，H/D交換幾乎完全由堿催化控制，kint,acid和kint,water的影響可以忽略不計(jì)[29]。

1.1.2 溫 度除pH值以外，溫度也是影響交換速率的重要因素。生理?xiàng)l件下，HDX的活化能約為17 kcal/mol，環(huán)境溫度每增加10 ℃，交換速率增加3倍[29,32]。根據(jù)公式(2)可以預(yù)測(cè)交換速率kch隨溫度變化的關(guān)系:

kch(T)=k293exp(-Ea/R[1/T-1/293])

(2)

其中，k293代表293 K時(shí)kint,acid、kint,base或kint,water的交換速率常數(shù)；Ea則是酸、堿或水催化HDX的活化能；R是氣體常數(shù)0.001 986 kcal·mol-1·K-1。當(dāng)溫度從25 ℃降低至0 ℃，交換速率約降低14倍[29]。溫度降低，分子動(dòng)能和擴(kuò)散速度減小，蛋白質(zhì)骨架酰胺氫氘交換速率也隨之減小。Quench條件下(pH 2.5，0 ℃)，HDX速率最小,不易發(fā)生回交。因此，為了提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)精確控制pH值和溫度，減少回交。

1.2 交換機(jī)制

上述因素均可以顯著影響交換速率(高達(dá)兩個(gè)數(shù)量級(jí))，但是對(duì)于折疊蛋白而言，蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)HDX速率影響更大，骨架酰胺氫交換速率主要受到氫鍵和溶劑可及性的影響[33]。若酰胺氫參與形成穩(wěn)定的氫鍵或是位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，則該位點(diǎn)酰胺氫交換速率非常緩慢。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，酰胺氫的狀態(tài)也會(huì)隨之改變，交換速率因此而不同。

折疊蛋白的骨架酰胺氫原子與溶劑(D2O)交換遵循以下機(jī)制:

(3)

kop和kcl是蛋白質(zhì)Opening和Closing狀態(tài)的速率常數(shù)。當(dāng)?shù)鞍滋幱贠pening狀態(tài)時(shí)代表不參與形成氫鍵的酰胺氫，可與溶劑發(fā)生交換；相反，在蛋白處于Closing狀態(tài)時(shí)，代表參與形成氫鍵的酰胺氫，位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，不發(fā)生HDX。kch則是酰胺氫的固有交換速率常數(shù)。當(dāng)kop>>kcl，交換速率主要受kch影響，此時(shí)蛋白質(zhì)處于Opening狀態(tài)。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于一個(gè)類似于Native的構(gòu)象狀態(tài)時(shí)，kop<

(4)

根據(jù)kch和kcl之間的相對(duì)速率，HDX分為EX1和EX2兩種不同的交換機(jī)制[34-35]。當(dāng)處于EX1動(dòng)力學(xué)狀態(tài)時(shí)(很少發(fā)生在Native構(gòu)象)，kcl<

1.3 HDX-MS實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系和目的不同，HDX-MS實(shí)驗(yàn)可分為多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)步驟與方法，但任何HDX-MS實(shí)驗(yàn)方法都包含氘標(biāo)記、氘代位點(diǎn)空間定位和數(shù)據(jù)處理與分析3大主要步驟。 氘標(biāo)記可分為連續(xù)標(biāo)記(Continuous labelling)和脈沖標(biāo)記(Pulse labelling)兩大類[36]。大多數(shù)HDX-MS實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)標(biāo)記策略。在連續(xù)標(biāo)記方法中，蛋白樣品置于重水(D2O)緩沖溶液中，但仍保持其天然構(gòu)象(pD 7.4和生理緩沖條件)。蛋白質(zhì)樣品在氘代溶液中孵育一定時(shí)間(幾秒到幾小時(shí)不等)，然后在pH 2.5和0 ℃條件下終止反應(yīng)。這種策略能夠監(jiān)測(cè)氘代水平隨時(shí)間的變化，提供蛋白質(zhì)在平衡條件下的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化信息[37-38]。因此，連續(xù)標(biāo)記常用于研究蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合、表位定位等。而在脈沖標(biāo)記法中，蛋白質(zhì)首先受到某種方式的干擾，如添加化學(xué)變性劑、改變pH值或溫度，然后再將蛋白質(zhì)置于氘代緩沖溶液中(pD值通常為8.0～10.0)，在非常短的時(shí)間內(nèi)標(biāo)記(通常為10 s或更短)[37-38]，因此HDX只發(fā)生在溶劑暴露的位置且不涉及氫鍵。脈沖標(biāo)記可用于揭示蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制或去折疊時(shí)的構(gòu)象變化過(guò)程。

氘標(biāo)記之后，最直接的方法就是在完整蛋白水平測(cè)定HDX變化，通過(guò)將完整的蛋白質(zhì)直接注入LC-MS系統(tǒng)中，測(cè)定蛋白質(zhì)的總體質(zhì)量數(shù)變化。蛋白質(zhì)與不同的配體(蛋白、抑制劑等)孵育，H/D交換的差異得以可視化。但該策略不能提供任何氘代位點(diǎn)的信息及區(qū)域變化情況。目前常用bottom-up 策略實(shí)現(xiàn)氘代空間定位，蛋白質(zhì)在氘水中孵育不同時(shí)間后，在pH 2.5和0 ℃的條件下終止反應(yīng)，蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶(pepsin)酶切為肽段進(jìn)入LC-MS分析，氘的空間定位可以通過(guò)分析肽段的氘代水平來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖2)。實(shí)驗(yàn)流程主要分為以下5個(gè)步驟：(1)樣品氘代：蛋白樣品(蛋白復(fù)合物)在氘水(D2O)中孵育一定時(shí)間。(2)終止反應(yīng)：pH 2.5，0 ℃。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)中加入quench溶液調(diào)至pH 2.5，同時(shí)控制溫度為0 ℃，可將HDX速率控制到最低。但根據(jù)不同的蛋白樣品，quench溶液中也會(huì)加入不同濃度的變性劑(尿素或鹽酸胍)和還原劑(三(2-羧乙基)膦，TCEP)幫助蛋白質(zhì)變性還原，從而得到更好酶切效果，提高序列覆蓋率[39]。(3)酶切：為了減少在后續(xù)的分析中發(fā)生回交，quench之后的所有步驟都應(yīng)在pH 2.5和低溫下盡快完成，再利用酸性蛋白酶將蛋白質(zhì)酶切為肽段。實(shí)驗(yàn)中常用胃蛋白酶(pepsin)，其他酸性蛋白酶如fungal,和nepenthesin也同樣可用于HDX-MS[40-41]。(4)分離與質(zhì)譜檢測(cè)：氘代肽段通過(guò)低溫HPLC/UPLC分離，可以在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的分離并減少回交[42]，然后通過(guò)電噴霧電離進(jìn)入MS分析。根據(jù)氫氘之間的質(zhì)量差異，MS可通過(guò)測(cè)定肽段質(zhì)量中心位移來(lái)監(jiān)測(cè)HDX變化。(5)數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)分析和結(jié)果闡述是HDX-MS分析的重要步驟。雖然目前的軟件如Hexicon2[43]、HDWorkbench[44]、ExMS2[45]、HDExaminer(http://massspec.com/hdexaminer/)、HX-Express[46]、HDXFinder[47]、HDX-analyzer[48]、DECA[49]和Dynamx(https://www.waters.com/waters/library.htm?lid=134832928&locale=en_US)等可以幫助實(shí)現(xiàn)大部分的數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析，但是對(duì)所有譜圖的手動(dòng)檢查仍然十分必要。

圖2 Bottom-up HDX-MS實(shí)驗(yàn)流程圖[50]

1.4 HDX-MS技術(shù)研究最新進(jìn)展

避免回交、提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性以及快速實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)解析曾是HDX-MS技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸[51]。而實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)解決了這些難題，有效確立了HDX-MS技術(shù)在生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用地位。近年來(lái)，HDX-MS新技術(shù)和新方法的開(kāi)發(fā)主要集中在拓展研究體系復(fù)雜性、提高結(jié)構(gòu)分辨率和提升方法便捷性等方面。常規(guī)HDX-MS分析中，LC-MS峰容量的大小在一定程度上限制了所研究蛋白體系的大小和復(fù)雜程度。毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)不受傳質(zhì)阻力的限制和低溫的不利影響，可以實(shí)現(xiàn)肽段的快速分離。Ramsey課題組發(fā)現(xiàn)，與LC進(jìn)行的等效分離相比，CE分離復(fù)雜混合物的速度更快，峰容量幾乎是前者的3倍[52]。Sheff等最新研發(fā)的低溫納流(500 nL/min)色譜系統(tǒng)僅需0.5 pmol的蛋白上樣量就可以分析DNA-PKcs(469 kDa)的大型蛋白質(zhì)復(fù)合物，極大地提高了系統(tǒng)的峰容量[53]。此外，離子淌度(Ion mobility spectrometry,IMS)技術(shù)的發(fā)展也為進(jìn)一步提高峰容量提供了可能性。IMS可以在氣相中實(shí)現(xiàn)多一維分離，從而可以大幅提高峰容量[54]。這些新技術(shù)的不斷發(fā)展為拓展HDX-MS在復(fù)雜蛋白復(fù)合物體系中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。此外，目前利用HDX-MS獲得的結(jié)構(gòu)分辨率大多局限在肽段水平。串聯(lián)酶柱的應(yīng)用可以幫助獲得更多更小的重疊肽，提升結(jié)構(gòu)分辨率[55]。Hamuro等的研究也進(jìn)一步證明采用串聯(lián)酶柱可以達(dá)到單個(gè)氨基酸水平的結(jié)構(gòu)分辨率[56]。同樣，電子轉(zhuǎn)移/捕獲解離(ETD/ECD)串聯(lián)技術(shù)因不會(huì)誘導(dǎo)H/D scrambling且斷鍵均一的性質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)單個(gè)氨基酸水平分辨率提供了額外的選擇[57-58]。串聯(lián)酶柱和ETD/ECD方法高度兼容，二者聯(lián)用是未來(lái)實(shí)現(xiàn)HDX-MS技術(shù)結(jié)構(gòu)分辨率全面提升的不錯(cuò)選擇。此外，受TECP難以快速實(shí)現(xiàn)二硫鍵完全還原的影響[59]，富含二硫鍵的蛋白結(jié)構(gòu)信息的獲取往往有限。Mysling等發(fā)現(xiàn)電化學(xué)池可以在線快速還原蛋白二硫鍵，并可與HDX-MS兼容[60]，該技術(shù)用于分析神經(jīng)生長(zhǎng)因子β時(shí)使序列覆蓋率提高了近50%[61]。除傳統(tǒng)的bottom-up策略，top-down還可以用于研究那些不適用于bottom-up分析的蛋白體系，如Aβ1-42淀粉樣蛋白形成的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化[62]。最近，王冠博課題組將CE-HDX與top-down MS結(jié)合用于區(qū)分蛋白質(zhì)的共存構(gòu)象，并對(duì)構(gòu)象的結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行表征[63]。

除本文介紹的液相HDX外，氣相和固相HDX-MS近幾年也逐漸興起。氣相HDX是一種快速(微秒反應(yīng)時(shí)間)、靈敏的分析方法，可通過(guò)將蛋白側(cè)鏈非骨架酰胺氫與高度堿性的氣體ND3反應(yīng)，探究蛋白側(cè)鏈相互作用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響[64]。Topp教授課題組開(kāi)發(fā)的固相HDX-MS則可以用于蛋白質(zhì)凍干制劑的表征[65]。在固相HDX-MS中，凍干粉中的蛋白質(zhì)暴露在相對(duì)濕度和溫度可控的D2O蒸汽中，氘代水平可以反映蛋白固相狀態(tài)下，蛋白質(zhì)-輔料相互作用以及蛋白質(zhì)分子本身的構(gòu)象變化[65- 66]。因此，HDX-MS技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，也使得HDX-MS對(duì)具有高度挑戰(zhàn)性的復(fù)雜體系(如超大蛋白復(fù)合物[24,67-68]、高度異質(zhì)性的糖蛋白[69-70]、膜蛋白[22]和無(wú)序蛋白[23]等)的分析成為可能。

2 HDX-MS在蛋白及蛋白復(fù)合物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化和功能是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心，也是深入了解體內(nèi)生理和病理過(guò)程的先決條件。因此，圍繞蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化以及靶向藥物篩選、設(shè)計(jì)和作用機(jī)制等進(jìn)行研究，對(duì)于闡明蛋白在生理和病理過(guò)程的作用和推動(dòng)新藥研發(fā)至關(guān)重要[71]。HDX-MS能夠在蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物溶液體系下觀察蛋白構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化、配體結(jié)合并確定配體結(jié)合區(qū)域，而且還能觀察伴隨結(jié)合信息的蛋白質(zhì)構(gòu)象動(dòng)力學(xué)差異，其快速、靈敏的檢測(cè)特性可作為潛在的高通量藥物篩選平臺(tái)。

2.1 蛋白自身結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化

蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化往往與其功能息息相關(guān)，表征這種結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化對(duì)于理解結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系至關(guān)重要。其中，生理環(huán)境的變化可以改變蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而影響蛋白的生理學(xué)功能，如流感病毒膜表面的血凝素(HA)蛋白在酸性條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化釋放融合肽，使得病毒與細(xì)胞發(fā)生膜融合從而感染宿主。X-射線晶體學(xué)雖然提供了HA不同狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，但是難以捕捉HA在體內(nèi)酸性條件下的膜融合結(jié)構(gòu)變化過(guò)程。Garcia等采用HDX-MS首次研究并證明酸性條件下HA融合肽的釋放應(yīng)該在HA1松動(dòng)和HA2彈簧加載重新折疊之前[72]。這一研究為闡明膜融合病毒的機(jī)制以及藥物設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同樣，蛋白合成過(guò)程的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)也影響其生理學(xué)功能，例如，神經(jīng)生長(zhǎng)因子β(NGF)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正確發(fā)展至關(guān)重要。NGF具有兩種形式：成熟的NGF和proNGF。這兩種形式對(duì)神經(jīng)元有相反的作用：NGF誘導(dǎo)增殖，而proNGF則通過(guò)與常見(jiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75NTR)結(jié)合誘導(dǎo)凋亡。盡管NGF的結(jié)構(gòu)已得到解析，但是proNGF的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)一直未知。Trabjerg等的研究結(jié)果表明，proNGF的前體肽段存在一個(gè)局部的高級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)比二者HDX-MS交換數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，proNGF前體肽段的存在對(duì)其結(jié)構(gòu)中的3個(gè)loop區(qū)域起到穩(wěn)定作用。此外，該課題組在proNGF的前體肽段中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)N糖和兩個(gè)O糖修飾[73]。這些結(jié)果提高了對(duì)proNGF和NGF構(gòu)象特性的認(rèn)識(shí)，為在分子水平上闡明兩者的不同生物學(xué)效應(yīng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

除具有確定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)外，無(wú)序蛋白(Intrinsically disordered proteins，IDPs)也是重要的潛在藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控和癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[74]。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，IDPs比同等長(zhǎng)度的有序蛋白具有更多的結(jié)合腔，為靶向藥物設(shè)計(jì)提供了可能性[75]。然而，受其結(jié)構(gòu)特殊性的困擾，往往難以用X射線方法得到IDPs的晶體結(jié)構(gòu)。盡管NMR是研究蛋白動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的利器，但無(wú)序區(qū)域的NMR共振信號(hào)通常高度重疊難于解析。近年來(lái)，HDX-MS在IDPs結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用逐漸興起，并提供了重要結(jié)構(gòu)信息。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在乳腺癌等癌癥中起重要作用，是重要的藥物靶點(diǎn)。Keppel等采用HDX-MS研究了酪氨酸激酶EGFR、HER2和HER3 3種受體，發(fā)現(xiàn)與有序的激酶結(jié)構(gòu)域相比，C末端尾部吸收氘的速度更快，從而證明這3種蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)域在很大程度上是無(wú)序結(jié)構(gòu)[76](圖3)。而Iacob等的研究結(jié)果進(jìn)一步表明這些受體C末端結(jié)構(gòu)域的無(wú)序和擴(kuò)展構(gòu)象有助于增加信號(hào)伴侶的捕獲半徑[77]。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)這些受體酪氨酸激酶(RTKs)的下游信號(hào)蛋白和信號(hào)傳導(dǎo)的理解具有重要意義。

除此之外，HDX-MS還廣泛應(yīng)用于生物制藥生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中的高階結(jié)構(gòu)表征和質(zhì)量控制。蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)依賴于細(xì)胞表達(dá)，生物合成過(guò)程中產(chǎn)生的不同程度的PTMs是誘導(dǎo)藥物三維結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的重要因素[78-79]。Houde等采用整體和局部HDX-MS技術(shù)對(duì)PTMs(如甲硫氨酸氧化、鹽藻糖糖基化和半乳糖糖基化等)如何影響重組單克隆抗體IgG1的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。以糖基化結(jié)果為例，整體HDX分析顯示IgG1具有高度穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而局部HDX研究則顯示糖基化區(qū)域去糖基后氘代水平發(fā)生改變，說(shuō)明糖基化會(huì)影響抗體對(duì)受體的識(shí)別[80-81]。同樣，HDX-MS還可用于表征復(fù)雜且異質(zhì)性高的生物藥物體系，如重組因子IX-Fc融合蛋白[82]。

圖3 EGFR、HER2和HER3的HDX-MS曲線[76]

圖4 氘代30 s(A)、300 s(B)和15 h(C)后，卡拉洛爾與β2 AR結(jié)合的HDX結(jié)果映射到β2 AR T4L晶體結(jié)構(gòu)(PDB：2RH1)[84]

2.2 蛋白質(zhì)-小分子相互作用

生理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)結(jié)合小分子配體發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，研究蛋白與小分子化合物的作用機(jī)制，識(shí)別小分子結(jié)合和變構(gòu)區(qū)域，觀察靶蛋白結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，有助于闡明蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)及藥物作用機(jī)制。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前研究最為廣泛的藥物靶點(diǎn)之一[83]。GPCRs是最大的細(xì)胞膜表面信號(hào)蛋白家族，可將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這種傳導(dǎo)通過(guò)配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化來(lái)實(shí)現(xiàn)，并通常伴有受體遠(yuǎn)端區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化。Griffin課題組以β2-腎上腺素能受體(β2-AR)膜蛋白為例，通過(guò)優(yōu)化HDX-MS的實(shí)驗(yàn)參數(shù)和選擇適宜的去污劑，有效提高了蛋白序列覆蓋率。該研究分析了在拮抗劑卡拉洛爾作用下β2-AR的配體依賴性構(gòu)象變化(圖4)，提供了受體的高度動(dòng)態(tài)區(qū)域和化學(xué)修飾信息[84]。后續(xù)研究分別在不同配體(從完全激動(dòng)劑到拮抗劑)存在的情況下，闡述了β2-AR的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化[85]。此工作為后續(xù)研究膜蛋白提供了方法指導(dǎo)，并證明了HDX-MS用于測(cè)定蛋白功能的實(shí)用性。

與GPCR一樣，離子通道也是藥物作用的重要靶點(diǎn)之一。所有的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(NSSs)都存在結(jié)合與不結(jié)合配體兩種狀態(tài)之間的構(gòu)象動(dòng)態(tài)平衡，但現(xiàn)有研究結(jié)構(gòu)都不能很好地解釋轉(zhuǎn)運(yùn)體這兩種狀態(tài)之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變及運(yùn)輸機(jī)制。Rand課題組最近先后研究了亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Leucine transporter,LeuT)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Human serotonin transporter,SERT)和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dopamine transporter,DAT)3種轉(zhuǎn)運(yùn)體兩種狀態(tài)之間的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化，為深入理解NSSs功能背后的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[86-88]。

HDX-MS還可以通過(guò)研究小分子與靶蛋白的作用機(jī)制進(jìn)一步輔助藥物研發(fā)與設(shè)計(jì)。例如，腺嘌呤核苷酸(AMP)依賴的蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，也是研究代謝疾病的重要靶點(diǎn)。Griffin課題組利用HDX-MS發(fā)現(xiàn)AMP與AMPK結(jié)合主要引起γ亞基構(gòu)象變化，α和β亞基變化微小。小分子激動(dòng)劑A769662則結(jié)合在α和β亞基之間，兩種配體激活A(yù)MPK的分子機(jī)制不同[89]。這些數(shù)據(jù)為設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)用于治療AMPK相關(guān)代謝疾病提供了研究依據(jù)。

此外，在基于片段藥物設(shè)計(jì)尋找先導(dǎo)化合物的方法中，HDX-MS也可以作為潛在的高通量篩選平臺(tái)?；谂潴w調(diào)節(jié)維生素D受體(VDR)在骨質(zhì)疏松癥的口服治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，Carson等利用HDX-MS識(shí)別片段與VDR的結(jié)合區(qū)域，對(duì)潛在的結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一些同天然激素VD3的結(jié)合區(qū)域類似的片段，這些信息可以輔助先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化[90]。Anand課題組采用HDX-MS對(duì)Hsp 90 N端ATPase結(jié)構(gòu)域與高親和力配體(KD≈20 nmol/L)和低親和力片段(KD≈500 μmol/L)結(jié)合的互作進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了配體與片段的結(jié)合區(qū)域和遠(yuǎn)端變構(gòu)區(qū)域[91]。此外，與傳統(tǒng)藥物篩選平臺(tái)相比，研究還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)母核相同、親和度(Kd)相近的低親和力片段之間的氘代水平也存在顯著差異，由此證明HDX-MS可以用于低親和力化合物的結(jié)構(gòu)篩選。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interactions,PPIs)參與了眾多細(xì)胞內(nèi)生理過(guò)程，如信號(hào)傳導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運(yùn)和各種代謝途徑等。而異常的PPIs是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生的原因，識(shí)別體內(nèi)的PPIs作用界面有助于藥物設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。IL-23R及其同源細(xì)胞因子IL-23形成的復(fù)合物與自身免疫性疾病相關(guān)。Sayago等利用HDX-MS確定了IL-23R和IL-23結(jié)合區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后，IL-23R的N端免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)明顯的氘代水平降低現(xiàn)象?；卺槍?duì)PPIs互作界面設(shè)計(jì)藥物的思路，他們進(jìn)行了多肽抑制劑的設(shè)計(jì)，并結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定了多肽與IL-23R的結(jié)合作用位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了靶向PPI界面設(shè)計(jì)藥物的目的[92]。

生物體內(nèi)的蛋白往往以多蛋白復(fù)合物形式發(fā)揮生理功能。因此，針對(duì)多蛋白復(fù)雜體系的結(jié)構(gòu)研究有助于對(duì)蛋白功能的進(jìn)一步理解。GroEL/ES伴侶蛋白系統(tǒng)可以促進(jìn)和增強(qiáng)底物蛋白的折疊途徑，但機(jī)制尚不清楚。Georgescauld等采用HDX-MS分析DapA(GroEL依賴的TIM桶狀蛋白)自發(fā)折疊和輔助折疊過(guò)程，發(fā)現(xiàn)DapA自發(fā)折疊需要較長(zhǎng)的時(shí)間，而通過(guò)GroEL/ES催化可將折疊加速30倍以上[68]。由此說(shuō)明GroEL依賴的TIM桶狀蛋白需要通過(guò)GroEL/ES進(jìn)行折疊催化才能在生物學(xué)相關(guān)的時(shí)間尺度上達(dá)到天然狀態(tài)，從而避免聚集或降解。

此外，HDX-MS還廣泛應(yīng)用于抗體-抗原互作表位的識(shí)別，這對(duì)抗體藥物作用機(jī)制的闡明尤為重要。白喉類毒素(DT)抗原是兒科和增強(qiáng)聯(lián)合疫苗的主要成分之一，然而，對(duì)白喉毒素(DTx)表位的結(jié)構(gòu)解析以及潛在的抗體中和機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。Zhu等利用HDX-MS和生物膜層干涉技術(shù)(BLI)識(shí)別兩種單克隆抗體(mAbs)在白喉毒素上的特異性表位，結(jié)果表明兩種mAbs的作用機(jī)制完全不同。單克隆抗體2-25選擇性地與DTx的b亞基結(jié)合，相反，2-18與a亞基結(jié)合[93]。這一結(jié)果闡明了抗體中和機(jī)制，并有助于揭示影響白喉疫苗療效的潛在因素。HDX-MS還可以用于研究復(fù)雜的抗原表位定位[94-100]。例如，HIV包膜糖蛋白(Env)是中和抗體的唯一靶點(diǎn)，但目前已報(bào)道的結(jié)構(gòu)大多是廣泛中和抗體(bnab)與截?cái)嗟腅nv亞基或組分形成的復(fù)合物。它們與完整的Env三聚體之間的相互作用以及在生理環(huán)境中形成中和抗性結(jié)構(gòu)的決定因素尚未得到確定。Guttman等采用HDX-MS首次研究并報(bào)道了一組廣泛中和抗體(Broadly neutralizing antibodies,bNAbs)和native-like Env三聚體之間的相互作用(SOSIP.664三聚體)。如圖5所示，VRC01 (IC50=0.32 μg·mL-1)和b12(IC50=2.82 μg·mL-1)都是識(shí)別CD4結(jié)合位點(diǎn)(CD4 binding site,CD4bs)的抗體，高特異性VRC01 Fab只在其結(jié)合界面產(chǎn)生局部效應(yīng)，而低特異性b12 Fab結(jié)合則與整個(gè)三聚體的復(fù)雜變化有關(guān)(結(jié)合界面顯示為綠色)。結(jié)果表明，弱效的抗體只能在三聚體短暫的開(kāi)放狀態(tài)下結(jié)合[100]。不僅如此，HDX-MS技術(shù)還可以研究單個(gè)抗體與蛋白復(fù)合物的結(jié)合機(jī)制或是多個(gè)抗體與單個(gè)抗原的作用機(jī)制。VHH6是一種識(shí)別IL-6-gp80復(fù)合物但不單獨(dú)識(shí)別單個(gè)蛋白亞基的抗體，Adams等利用HDX-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)VHH6的CDR區(qū)域與IL-6和gp80同時(shí)相互作用，將兩者鎖定在一起，這一結(jié)果為篩選和結(jié)構(gòu)輔助藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的視角[101]。Zhang等則采用HDX研究4個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性抗體單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)天然花粉過(guò)敏原蛋白(Bet v1)的作用機(jī)制。HDX結(jié)果表明，4種抗Bet v1抗體保護(hù)了Bet v1的特定區(qū)域，從而解釋了單克隆抗體與多克隆抗體IgEs結(jié)合Bet v1阻斷效率的差異。作者首次應(yīng)用HDX闡明了聯(lián)合抗體與單獨(dú)抗體治療Bet v1誘導(dǎo)過(guò)敏的優(yōu)勢(shì)，為后續(xù)藥物設(shè)計(jì)提供了新思路[102]。

圖5 靶向CD4bs的bNAb結(jié)合的影響[100]

3 總結(jié)與展望

盡管HDX-MS技術(shù)在國(guó)外藥物研發(fā)流程中廣泛應(yīng)用，但受技術(shù)細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)解析、重現(xiàn)性等多因素的限制，目前HDX-MS在國(guó)內(nèi)生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用還較少。因此，建立規(guī)范化的、具有行業(yè)共識(shí)的實(shí)驗(yàn)流程和方案，進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)自動(dòng)解析度，建立蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)信息中央HDX數(shù)據(jù)庫(kù)是全面推廣HDX-MS技術(shù)的關(guān)鍵。此外，串聯(lián)酶柱、液相-氣相分離技術(shù)的結(jié)合以及與ETD/ECD解離多種技術(shù)的串聯(lián)應(yīng)用也將是未來(lái)提升HDX-MS結(jié)構(gòu)信息分辨率的發(fā)展趨勢(shì)。而在此基礎(chǔ)上，采用針對(duì)性開(kāi)發(fā)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從HDX數(shù)據(jù)中提取出保護(hù)因子(Protection factor)則有望全面實(shí)現(xiàn)HDX-MS技術(shù)的單氨基酸分辨率[103]。而氣相或是在電噴霧界面發(fā)生的HDX-MS將拓展我們對(duì)蛋白側(cè)鏈氫如何參與氫鍵和鹽橋作用，穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。最后，HDX-MS與其他生物質(zhì)譜技術(shù)如交聯(lián)質(zhì)譜(Cross-linking mass spectrometry，CX-MS)[104]、非變性質(zhì)譜(Native mass spectrometry)[105]和共價(jià)標(biāo)記質(zhì)譜(Covalent labeling mass spectrometry,CL-MS)[106]聯(lián)用，也同樣將拓展和加深我們對(duì)蛋白質(zhì)/蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)信息的認(rèn)識(shí)，為靶向藥物設(shè)計(jì)提供結(jié)構(gòu)和方法學(xué)基礎(chǔ)。