黃 靜，李惠琳,2*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東省手性分子與藥物發(fā)現(xiàn)重點實驗室，廣東 廣州 510006)

蛋白質(zhì)(Protein)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)控生命體內(nèi)幾乎所有的生物學(xué)過程[1-2]。蛋白質(zhì)在一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的基礎(chǔ)上折疊、盤曲成特定的空間結(jié)構(gòu)而具有功能[3]，其功能受結(jié)構(gòu)動態(tài)變化[4-5]、配體(如小分子、蛋白質(zhì)或DNA等)相互作用及翻譯后修飾(Post translational modifications,PTMs)的調(diào)節(jié)[6]。因此，對生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的深入研究不僅有助于揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)，更與人類健康息息相關(guān)，并將極大地促進(jìn)藥物靶點發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)。

在過去的40年中，結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段如X-射線晶體學(xué)(X-ray crystallography)[7]、核磁共振(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)[8]、冷凍電鏡(Electron cryomicroscopy,cryoEM)[9]、中子晶體衍射(Neutron diffraction)[10]和小角衍射(Small-angle scattering,SAS)[11]等技術(shù)的發(fā)展極大地推動了人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理解。不同的生物物理學(xué)方法各有優(yōu)勢和局限性。X-射線晶體學(xué)可以提供高分辨率(原子水平)的結(jié)構(gòu)信息，但大分子量的蛋白復(fù)合物往往難以結(jié)晶。NMR能夠在更接近于生理狀態(tài)下獲得蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)信息，但目前更多局限于分子量較小(<～50 kDa)的蛋白樣品，且對蛋白質(zhì)樣品濃度要求較高。近年來，cryoEM技術(shù)的迅猛發(fā)展極大地拓展了人們對大蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的認(rèn)知，并且所需樣品量少，可以獲得較高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，但其分辨率往往受到樣品異質(zhì)性和分子量大小的影響。全面解析蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能通常需要結(jié)合多種技術(shù)手段來實現(xiàn)，因此，互補技術(shù)的不斷發(fā)展對于蛋白結(jié)構(gòu)分析也起到了越來越重要的作用。

除了傳統(tǒng)的生物物理學(xué)方法，質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)領(lǐng)域的研究。1980年代末，軟電離技術(shù)如基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)的發(fā)明推動了生物質(zhì)譜的飛速發(fā)展，使得生物大分子能夠以完整離子的形式被轉(zhuǎn)移到氣相中，從而被不同類型的質(zhì)量分析器所檢測[12]。質(zhì)譜分析不僅可用于鑒定蛋白序列和翻譯后修飾[13]，還能用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、折疊和動力學(xué)機制[14-16]。其中，氫氘交換質(zhì)譜(Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的一種強有力工具，也是對傳統(tǒng)生物物理手段的重要補充[17]。氫氘交換(HDX)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)早已不是一個新的概念。Linderstr?m-Lang在1954年的工作中首次將蛋白質(zhì)置于D2O中，利用密度梯度管測定氫氘交換速率從而研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[18]，并由此奠定了HDX的理論基礎(chǔ)[19]。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)可通過結(jié)合低溫超高壓高效液相色譜和質(zhì)譜儀器分析確定酰胺氫氘交換的位置和速率。此外，實驗分析流程和前期數(shù)據(jù)處理的自動化使得HDX-MS技術(shù)發(fā)展迅速，成為一種有效的蛋白結(jié)構(gòu)分析工具[20]。雖然HDX-MS不能獲得高分辨率的蛋白結(jié)構(gòu)信息，但其優(yōu)點在于基本不受分析體系的大小和復(fù)雜程度的限制[21]，樣品需求量少，并且還可用于研究對于傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)學(xué)分析方法具有挑戰(zhàn)的蛋白體系，如膜蛋白[22]、無序蛋白[23]和超大蛋白復(fù)合物[24]。本文首先介紹了HDX-MS的基本原理、交換機制、實驗方法和技術(shù)研究進(jìn)展，隨后從蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用3個方面對HDX-MS的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

圖1 骨架酰胺H(綠色)、側(cè)鏈H(藍(lán)色)和碳原子相連的H(黃色)

1 氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)概述

1.1 基本原理

HDX技術(shù)利用蛋白質(zhì)中不穩(wěn)定的氫原子可以與溶液中的氘原子發(fā)生交換的化學(xué)反應(yīng)特性研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[19]，不同類型的氫原子H/D交換速率不同(圖1)。例如，C—H鍵幾乎不發(fā)生溶劑介導(dǎo)的交換；蛋白質(zhì)N端和氨基酸側(cè)鏈 (—OH,—SH,—NH)的H/D交換速率快，半衰期短(0.01～1 ms)，并且交換上去的氘原子在分析后期很容易被溶液中的氫原子交換下來(回交，Back exchange)，很難通過質(zhì)譜方法檢測[25]；而骨架酰胺H/D交換速率相對緩慢，可以利用MS通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量變化來監(jiān)測交換反應(yīng)。蛋白質(zhì)的每個氨基酸(脯氨酸除外)都存在一個骨架酰胺氫，因此，骨架酰胺的H/D交換水平反映了蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。通過比較蛋白質(zhì)在不同狀態(tài)下氘代水平的變化，可以獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化的信息。然而，主鏈酰胺氫交換速率受氫鍵、溶劑性質(zhì)(pH值、溫度)以及蛋白質(zhì)構(gòu)象動態(tài)變化的影響，可以發(fā)生顯著變化[25-27]。

1.1.1 pH值氫氘交換是一類酸堿催化反應(yīng)[28]，酰胺氫的交換速率(kch)符合公式:

kch=kint,acid[H3O+]+kint,base[OH-]+kint,water[H2O]

(1)

其中，kint,acid和kint,base分別代表酸催化和堿催化的速率系數(shù)，kint,water則表示水催化質(zhì)子轉(zhuǎn)移的固有系數(shù)[28-29]。由公式(1)可知，酰胺氫交換速率高度依賴于環(huán)境pH值的變化。pH值低于2.5～3.0時，酸催化為主導(dǎo)；當(dāng)pH值大于3.0時，質(zhì)子轉(zhuǎn)移主要受堿催化反應(yīng)控制[30-31]。pH值位于2.5～3.0之間時，交換速率最小(約比pH 7.0時低105倍)，稱為pHmin。值得注意的是，生理環(huán)境下(pH 7.0～7.4)，H/D交換幾乎完全由堿催化控制，kint,acid和kint,water的影響可以忽略不計[29]。

1.1.2 溫 度除pH值以外，溫度也是影響交換速率的重要因素。生理條件下，HDX的活化能約為17 kcal/mol，環(huán)境溫度每增加10 ℃，交換速率增加3倍[29,32]。根據(jù)公式(2)可以預(yù)測交換速率kch隨溫度變化的關(guān)系:

kch(T)=k293exp(-Ea/R[1/T-1/293])

(2)

其中，k293代表293 K時kint,acid、kint,base或kint,water的交換速率常數(shù)；Ea則是酸、堿或水催化HDX的活化能；R是氣體常數(shù)0.001 986 kcal·mol-1·K-1。當(dāng)溫度從25 ℃降低至0 ℃，交換速率約降低14倍[29]。溫度降低，分子動能和擴散速度減小，蛋白質(zhì)骨架酰胺氫氘交換速率也隨之減小。Quench條件下(pH 2.5，0 ℃)，HDX速率最小,不易發(fā)生回交。因此，為了提高實驗的重現(xiàn)性，實驗過程中應(yīng)精確控制pH值和溫度，減少回交。

1.2 交換機制

上述因素均可以顯著影響交換速率(高達(dá)兩個數(shù)量級)，但是對于折疊蛋白而言，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)對HDX速率影響更大，骨架酰胺氫交換速率主要受到氫鍵和溶劑可及性的影響[33]。若酰胺氫參與形成穩(wěn)定的氫鍵或是位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，則該位點酰胺氫交換速率非常緩慢。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化時，酰胺氫的狀態(tài)也會隨之改變，交換速率因此而不同。

折疊蛋白的骨架酰胺氫原子與溶劑(D2O)交換遵循以下機制:

(3)

kop和kcl是蛋白質(zhì)Opening和Closing狀態(tài)的速率常數(shù)。當(dāng)?shù)鞍滋幱贠pening狀態(tài)時代表不參與形成氫鍵的酰胺氫，可與溶劑發(fā)生交換；相反，在蛋白處于Closing狀態(tài)時，代表參與形成氫鍵的酰胺氫，位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，不發(fā)生HDX。kch則是酰胺氫的固有交換速率常數(shù)。當(dāng)kop>>kcl，交換速率主要受kch影響，此時蛋白質(zhì)處于Opening狀態(tài)。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于一個類似于Native的構(gòu)象狀態(tài)時，kop<

(4)

根據(jù)kch和kcl之間的相對速率，HDX分為EX1和EX2兩種不同的交換機制[34-35]。當(dāng)處于EX1動力學(xué)狀態(tài)時(很少發(fā)生在Native構(gòu)象)，kcl<

1.3 HDX-MS實驗方法

根據(jù)實驗體系和目的不同，HDX-MS實驗可分為多個不同的實驗步驟與方法，但任何HDX-MS實驗方法都包含氘標(biāo)記、氘代位點空間定位和數(shù)據(jù)處理與分析3大主要步驟。 氘標(biāo)記可分為連續(xù)標(biāo)記(Continuous labelling)和脈沖標(biāo)記(Pulse labelling)兩大類[36]。大多數(shù)HDX-MS實驗采用連續(xù)標(biāo)記策略。在連續(xù)標(biāo)記方法中，蛋白樣品置于重水(D2O)緩沖溶液中，但仍保持其天然構(gòu)象(pD 7.4和生理緩沖條件)。蛋白質(zhì)樣品在氘代溶液中孵育一定時間(幾秒到幾小時不等)，然后在pH 2.5和0 ℃條件下終止反應(yīng)。這種策略能夠監(jiān)測氘代水平隨時間的變化，提供蛋白質(zhì)在平衡條件下的構(gòu)象動態(tài)變化信息[37-38]。因此，連續(xù)標(biāo)記常用于研究蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合、表位定位等。而在脈沖標(biāo)記法中，蛋白質(zhì)首先受到某種方式的干擾，如添加化學(xué)變性劑、改變pH值或溫度，然后再將蛋白質(zhì)置于氘代緩沖溶液中(pD值通常為8.0～10.0)，在非常短的時間內(nèi)標(biāo)記(通常為10 s或更短)[37-38]，因此HDX只發(fā)生在溶劑暴露的位置且不涉及氫鍵。脈沖標(biāo)記可用于揭示蛋白質(zhì)的折疊機制或去折疊時的構(gòu)象變化過程。

氘標(biāo)記之后，最直接的方法就是在完整蛋白水平測定HDX變化，通過將完整的蛋白質(zhì)直接注入LC-MS系統(tǒng)中，測定蛋白質(zhì)的總體質(zhì)量數(shù)變化。蛋白質(zhì)與不同的配體(蛋白、抑制劑等)孵育，H/D交換的差異得以可視化。但該策略不能提供任何氘代位點的信息及區(qū)域變化情況。目前常用bottom-up 策略實現(xiàn)氘代空間定位，蛋白質(zhì)在氘水中孵育不同時間后，在pH 2.5和0 ℃的條件下終止反應(yīng)，蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶(pepsin)酶切為肽段進(jìn)入LC-MS分析，氘的空間定位可以通過分析肽段的氘代水平來實現(xiàn)(圖2)。實驗流程主要分為以下5個步驟：(1)樣品氘代：蛋白樣品(蛋白復(fù)合物)在氘水(D2O)中孵育一定時間。(2)終止反應(yīng)：pH 2.5，0 ℃。一般來說，實驗中加入quench溶液調(diào)至pH 2.5，同時控制溫度為0 ℃，可將HDX速率控制到最低。但根據(jù)不同的蛋白樣品，quench溶液中也會加入不同濃度的變性劑(尿素或鹽酸胍)和還原劑(三(2-羧乙基)膦，TCEP)幫助蛋白質(zhì)變性還原，從而得到更好酶切效果，提高序列覆蓋率[39]。(3)酶切：為了減少在后續(xù)的分析中發(fā)生回交，quench之后的所有步驟都應(yīng)在pH 2.5和低溫下盡快完成，再利用酸性蛋白酶將蛋白質(zhì)酶切為肽段。實驗中常用胃蛋白酶(pepsin)，其他酸性蛋白酶如fungal,和nepenthesin也同樣可用于HDX-MS[40-41]。(4)分離與質(zhì)譜檢測：氘代肽段通過低溫HPLC/UPLC分離，可以在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)較好的分離并減少回交[42]，然后通過電噴霧電離進(jìn)入MS分析。根據(jù)氫氘之間的質(zhì)量差異，MS可通過測定肽段質(zhì)量中心位移來監(jiān)測HDX變化。(5)數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)分析和結(jié)果闡述是HDX-MS分析的重要步驟。雖然目前的軟件如Hexicon2[43]、HDWorkbench[44]、ExMS2[45]、HDExaminer(http://massspec.com/hdexaminer/)、HX-Express[46]、HDXFinder[47]、HDX-analyzer[48]、DECA[49]和Dynamx(https://www.waters.com/waters/library.htm?lid=134832928&locale=en_US)等可以幫助實現(xiàn)大部分的數(shù)據(jù)自動化分析，但是對所有譜圖的手動檢查仍然十分必要。

圖2 Bottom-up HDX-MS實驗流程圖[50]

1.4 HDX-MS技術(shù)研究最新進(jìn)展

避免回交、提高實驗準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性以及快速實現(xiàn)數(shù)據(jù)解析曾是HDX-MS技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸[51]。而實驗流程和數(shù)據(jù)處理自動化的實現(xiàn)解決了這些難題，有效確立了HDX-MS技術(shù)在生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用地位。近年來，HDX-MS新技術(shù)和新方法的開發(fā)主要集中在拓展研究體系復(fù)雜性、提高結(jié)構(gòu)分辨率和提升方法便捷性等方面。常規(guī)HDX-MS分析中，LC-MS峰容量的大小在一定程度上限制了所研究蛋白體系的大小和復(fù)雜程度。毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)不受傳質(zhì)阻力的限制和低溫的不利影響，可以實現(xiàn)肽段的快速分離。Ramsey課題組發(fā)現(xiàn)，與LC進(jìn)行的等效分離相比，CE分離復(fù)雜混合物的速度更快，峰容量幾乎是前者的3倍[52]。Sheff等最新研發(fā)的低溫納流(500 nL/min)色譜系統(tǒng)僅需0.5 pmol的蛋白上樣量就可以分析DNA-PKcs(469 kDa)的大型蛋白質(zhì)復(fù)合物，極大地提高了系統(tǒng)的峰容量[53]。此外，離子淌度(Ion mobility spectrometry,IMS)技術(shù)的發(fā)展也為進(jìn)一步提高峰容量提供了可能性。IMS可以在氣相中實現(xiàn)多一維分離，從而可以大幅提高峰容量[54]。這些新技術(shù)的不斷發(fā)展為拓展HDX-MS在復(fù)雜蛋白復(fù)合物體系中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。此外，目前利用HDX-MS獲得的結(jié)構(gòu)分辨率大多局限在肽段水平。串聯(lián)酶柱的應(yīng)用可以幫助獲得更多更小的重疊肽，提升結(jié)構(gòu)分辨率[55]。Hamuro等的研究也進(jìn)一步證明采用串聯(lián)酶柱可以達(dá)到單個氨基酸水平的結(jié)構(gòu)分辨率[56]。同樣，電子轉(zhuǎn)移/捕獲解離(ETD/ECD)串聯(lián)技術(shù)因不會誘導(dǎo)H/D scrambling且斷鍵均一的性質(zhì)，為實現(xiàn)單個氨基酸水平分辨率提供了額外的選擇[57-58]。串聯(lián)酶柱和ETD/ECD方法高度兼容，二者聯(lián)用是未來實現(xiàn)HDX-MS技術(shù)結(jié)構(gòu)分辨率全面提升的不錯選擇。此外，受TECP難以快速實現(xiàn)二硫鍵完全還原的影響[59]，富含二硫鍵的蛋白結(jié)構(gòu)信息的獲取往往有限。Mysling等發(fā)現(xiàn)電化學(xué)池可以在線快速還原蛋白二硫鍵，并可與HDX-MS兼容[60]，該技術(shù)用于分析神經(jīng)生長因子β時使序列覆蓋率提高了近50%[61]。除傳統(tǒng)的bottom-up策略，top-down還可以用于研究那些不適用于bottom-up分析的蛋白體系，如Aβ1-42淀粉樣蛋白形成的構(gòu)象動態(tài)變化[62]。最近，王冠博課題組將CE-HDX與top-down MS結(jié)合用于區(qū)分蛋白質(zhì)的共存構(gòu)象，并對構(gòu)象的結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行表征[63]。

除本文介紹的液相HDX外，氣相和固相HDX-MS近幾年也逐漸興起。氣相HDX是一種快速(微秒反應(yīng)時間)、靈敏的分析方法，可通過將蛋白側(cè)鏈非骨架酰胺氫與高度堿性的氣體ND3反應(yīng)，探究蛋白側(cè)鏈相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響[64]。Topp教授課題組開發(fā)的固相HDX-MS則可以用于蛋白質(zhì)凍干制劑的表征[65]。在固相HDX-MS中，凍干粉中的蛋白質(zhì)暴露在相對濕度和溫度可控的D2O蒸汽中，氘代水平可以反映蛋白固相狀態(tài)下，蛋白質(zhì)-輔料相互作用以及蛋白質(zhì)分子本身的構(gòu)象變化[65- 66]。因此，HDX-MS技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，也使得HDX-MS對具有高度挑戰(zhàn)性的復(fù)雜體系(如超大蛋白復(fù)合物[24,67-68]、高度異質(zhì)性的糖蛋白[69-70]、膜蛋白[22]和無序蛋白[23]等)的分析成為可能。

2 HDX-MS在蛋白及蛋白復(fù)合物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、動態(tài)變化和功能是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心，也是深入了解體內(nèi)生理和病理過程的先決條件。因此，圍繞蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動態(tài)變化以及靶向藥物篩選、設(shè)計和作用機制等進(jìn)行研究，對于闡明蛋白在生理和病理過程的作用和推動新藥研發(fā)至關(guān)重要[71]。HDX-MS能夠在蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物溶液體系下觀察蛋白構(gòu)象動態(tài)變化、配體結(jié)合并確定配體結(jié)合區(qū)域，而且還能觀察伴隨結(jié)合信息的蛋白質(zhì)構(gòu)象動力學(xué)差異，其快速、靈敏的檢測特性可作為潛在的高通量藥物篩選平臺。

2.1 蛋白自身結(jié)構(gòu)動態(tài)變化

蛋白結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化往往與其功能息息相關(guān)，表征這種結(jié)構(gòu)動態(tài)變化對于理解結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系至關(guān)重要。其中，生理環(huán)境的變化可以改變蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而影響蛋白的生理學(xué)功能，如流感病毒膜表面的血凝素(HA)蛋白在酸性條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化釋放融合肽，使得病毒與細(xì)胞發(fā)生膜融合從而感染宿主。X-射線晶體學(xué)雖然提供了HA不同狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，但是難以捕捉HA在體內(nèi)酸性條件下的膜融合結(jié)構(gòu)變化過程。Garcia等采用HDX-MS首次研究并證明酸性條件下HA融合肽的釋放應(yīng)該在HA1松動和HA2彈簧加載重新折疊之前[72]。這一研究為闡明膜融合病毒的機制以及藥物設(shè)計提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同樣，蛋白合成過程的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)也影響其生理學(xué)功能，例如，神經(jīng)生長因子β(NGF)對神經(jīng)系統(tǒng)的正確發(fā)展至關(guān)重要。NGF具有兩種形式：成熟的NGF和proNGF。這兩種形式對神經(jīng)元有相反的作用：NGF誘導(dǎo)增殖，而proNGF則通過與常見的神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)結(jié)合誘導(dǎo)凋亡。盡管NGF的結(jié)構(gòu)已得到解析，但是proNGF的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)一直未知。Trabjerg等的研究結(jié)果表明，proNGF的前體肽段存在一個局部的高級結(jié)構(gòu)。通過對比二者HDX-MS交換數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，proNGF前體肽段的存在對其結(jié)構(gòu)中的3個loop區(qū)域起到穩(wěn)定作用。此外，該課題組在proNGF的前體肽段中還發(fā)現(xiàn)了兩個N糖和兩個O糖修飾[73]。這些結(jié)果提高了對proNGF和NGF構(gòu)象特性的認(rèn)識，為在分子水平上闡明兩者的不同生物學(xué)效應(yīng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

除具有確定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)外，無序蛋白(Intrinsically disordered proteins，IDPs)也是重要的潛在藥物設(shè)計靶點，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、調(diào)控和癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[74]。對比研究發(fā)現(xiàn)，IDPs比同等長度的有序蛋白具有更多的結(jié)合腔，為靶向藥物設(shè)計提供了可能性[75]。然而，受其結(jié)構(gòu)特殊性的困擾，往往難以用X射線方法得到IDPs的晶體結(jié)構(gòu)。盡管NMR是研究蛋白動態(tài)結(jié)構(gòu)的利器，但無序區(qū)域的NMR共振信號通常高度重疊難于解析。近年來，HDX-MS在IDPs結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用逐漸興起，并提供了重要結(jié)構(gòu)信息。例如，表皮生長因子受體(EGFR)在乳腺癌等癌癥中起重要作用，是重要的藥物靶點。Keppel等采用HDX-MS研究了酪氨酸激酶EGFR、HER2和HER3 3種受體，發(fā)現(xiàn)與有序的激酶結(jié)構(gòu)域相比，C末端尾部吸收氘的速度更快，從而證明這3種蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)域在很大程度上是無序結(jié)構(gòu)[76](圖3)。而Iacob等的研究結(jié)果進(jìn)一步表明這些受體C末端結(jié)構(gòu)域的無序和擴展構(gòu)象有助于增加信號伴侶的捕獲半徑[77]。這一發(fā)現(xiàn)對這些受體酪氨酸激酶(RTKs)的下游信號蛋白和信號傳導(dǎo)的理解具有重要意義。

除此之外，HDX-MS還廣泛應(yīng)用于生物制藥生產(chǎn)和開發(fā)過程中的高階結(jié)構(gòu)表征和質(zhì)量控制。蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)依賴于細(xì)胞表達(dá)，生物合成過程中產(chǎn)生的不同程度的PTMs是誘導(dǎo)藥物三維結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的重要因素[78-79]。Houde等采用整體和局部HDX-MS技術(shù)對PTMs(如甲硫氨酸氧化、鹽藻糖糖基化和半乳糖糖基化等)如何影響重組單克隆抗體IgG1的構(gòu)象動態(tài)變化進(jìn)行了研究。以糖基化結(jié)果為例，整體HDX分析顯示IgG1具有高度穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)，而局部HDX研究則顯示糖基化區(qū)域去糖基后氘代水平發(fā)生改變，說明糖基化會影響抗體對受體的識別[80-81]。同樣，HDX-MS還可用于表征復(fù)雜且異質(zhì)性高的生物藥物體系，如重組因子IX-Fc融合蛋白[82]。

圖3 EGFR、HER2和HER3的HDX-MS曲線[76]

圖4 氘代30 s(A)、300 s(B)和15 h(C)后，卡拉洛爾與β2 AR結(jié)合的HDX結(jié)果映射到β2 AR T4L晶體結(jié)構(gòu)(PDB：2RH1)[84]

2.2 蛋白質(zhì)-小分子相互作用

生理條件下，蛋白質(zhì)結(jié)合小分子配體發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，研究蛋白與小分子化合物的作用機制，識別小分子結(jié)合和變構(gòu)區(qū)域，觀察靶蛋白結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，有助于闡明蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的動態(tài)關(guān)聯(lián)及藥物作用機制。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前研究最為廣泛的藥物靶點之一[83]。GPCRs是最大的細(xì)胞膜表面信號蛋白家族，可將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這種傳導(dǎo)通過配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化來實現(xiàn)，并通常伴有受體遠(yuǎn)端區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化。Griffin課題組以β2-腎上腺素能受體(β2-AR)膜蛋白為例，通過優(yōu)化HDX-MS的實驗參數(shù)和選擇適宜的去污劑，有效提高了蛋白序列覆蓋率。該研究分析了在拮抗劑卡拉洛爾作用下β2-AR的配體依賴性構(gòu)象變化(圖4)，提供了受體的高度動態(tài)區(qū)域和化學(xué)修飾信息[84]。后續(xù)研究分別在不同配體(從完全激動劑到拮抗劑)存在的情況下，闡述了β2-AR的構(gòu)象動態(tài)變化[85]。此工作為后續(xù)研究膜蛋白提供了方法指導(dǎo)，并證明了HDX-MS用于測定蛋白功能的實用性。

與GPCR一樣，離子通道也是藥物作用的重要靶點之一。所有的鈉離子轉(zhuǎn)運體(NSSs)都存在結(jié)合與不結(jié)合配體兩種狀態(tài)之間的構(gòu)象動態(tài)平衡，但現(xiàn)有研究結(jié)構(gòu)都不能很好地解釋轉(zhuǎn)運體這兩種狀態(tài)之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變及運輸機制。Rand課題組最近先后研究了亮氨酸轉(zhuǎn)運體(Leucine transporter,LeuT)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(Human serotonin transporter,SERT)和多巴胺轉(zhuǎn)運體(Dopamine transporter,DAT)3種轉(zhuǎn)運體兩種狀態(tài)之間的構(gòu)象動態(tài)變化，為深入理解NSSs功能背后的分子機制奠定了基礎(chǔ)[86-88]。

HDX-MS還可以通過研究小分子與靶蛋白的作用機制進(jìn)一步輔助藥物研發(fā)與設(shè)計。例如，腺嘌呤核苷酸(AMP)依賴的蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，也是研究代謝疾病的重要靶點。Griffin課題組利用HDX-MS發(fā)現(xiàn)AMP與AMPK結(jié)合主要引起γ亞基構(gòu)象變化，α和β亞基變化微小。小分子激動劑A769662則結(jié)合在α和β亞基之間，兩種配體激活A(yù)MPK的分子機制不同[89]。這些數(shù)據(jù)為設(shè)計和發(fā)現(xiàn)用于治療AMPK相關(guān)代謝疾病提供了研究依據(jù)。

此外，在基于片段藥物設(shè)計尋找先導(dǎo)化合物的方法中，HDX-MS也可以作為潛在的高通量篩選平臺。基于配體調(diào)節(jié)維生素D受體(VDR)在骨質(zhì)疏松癥的口服治療中具有潛在應(yīng)用價值，Carson等利用HDX-MS識別片段與VDR的結(jié)合區(qū)域，對潛在的結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一些同天然激素VD3的結(jié)合區(qū)域類似的片段，這些信息可以輔助先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化[90]。Anand課題組采用HDX-MS對Hsp 90 N端ATPase結(jié)構(gòu)域與高親和力配體(KD≈20 nmol/L)和低親和力片段(KD≈500 μmol/L)結(jié)合的互作進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了配體與片段的結(jié)合區(qū)域和遠(yuǎn)端變構(gòu)區(qū)域[91]。此外，與傳統(tǒng)藥物篩選平臺相比，研究還發(fā)現(xiàn)兩個結(jié)構(gòu)母核相同、親和度(Kd)相近的低親和力片段之間的氘代水平也存在顯著差異，由此證明HDX-MS可以用于低親和力化合物的結(jié)構(gòu)篩選。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interactions,PPIs)參與了眾多細(xì)胞內(nèi)生理過程，如信號傳導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運和各種代謝途徑等。而異常的PPIs是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生的原因，識別體內(nèi)的PPIs作用界面有助于藥物設(shè)計與開發(fā)。IL-23R及其同源細(xì)胞因子IL-23形成的復(fù)合物與自身免疫性疾病相關(guān)。Sayago等利用HDX-MS確定了IL-23R和IL-23結(jié)合區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后，IL-23R的N端免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)明顯的氘代水平降低現(xiàn)象。基于針對PPIs互作界面設(shè)計藥物的思路，他們進(jìn)行了多肽抑制劑的設(shè)計，并結(jié)合計算機模擬技術(shù)確定了多肽與IL-23R的結(jié)合作用位點，實現(xiàn)了靶向PPI界面設(shè)計藥物的目的[92]。

生物體內(nèi)的蛋白往往以多蛋白復(fù)合物形式發(fā)揮生理功能。因此，針對多蛋白復(fù)雜體系的結(jié)構(gòu)研究有助于對蛋白功能的進(jìn)一步理解。GroEL/ES伴侶蛋白系統(tǒng)可以促進(jìn)和增強底物蛋白的折疊途徑，但機制尚不清楚。Georgescauld等采用HDX-MS分析DapA(GroEL依賴的TIM桶狀蛋白)自發(fā)折疊和輔助折疊過程，發(fā)現(xiàn)DapA自發(fā)折疊需要較長的時間，而通過GroEL/ES催化可將折疊加速30倍以上[68]。由此說明GroEL依賴的TIM桶狀蛋白需要通過GroEL/ES進(jìn)行折疊催化才能在生物學(xué)相關(guān)的時間尺度上達(dá)到天然狀態(tài)，從而避免聚集或降解。

此外，HDX-MS還廣泛應(yīng)用于抗體-抗原互作表位的識別，這對抗體藥物作用機制的闡明尤為重要。白喉類毒素(DT)抗原是兒科和增強聯(lián)合疫苗的主要成分之一，然而，對白喉毒素(DTx)表位的結(jié)構(gòu)解析以及潛在的抗體中和機制尚無報道。Zhu等利用HDX-MS和生物膜層干涉技術(shù)(BLI)識別兩種單克隆抗體(mAbs)在白喉毒素上的特異性表位，結(jié)果表明兩種mAbs的作用機制完全不同。單克隆抗體2-25選擇性地與DTx的b亞基結(jié)合，相反，2-18與a亞基結(jié)合[93]。這一結(jié)果闡明了抗體中和機制，并有助于揭示影響白喉疫苗療效的潛在因素。HDX-MS還可以用于研究復(fù)雜的抗原表位定位[94-100]。例如，HIV包膜糖蛋白(Env)是中和抗體的唯一靶點，但目前已報道的結(jié)構(gòu)大多是廣泛中和抗體(bnab)與截斷的Env亞基或組分形成的復(fù)合物。它們與完整的Env三聚體之間的相互作用以及在生理環(huán)境中形成中和抗性結(jié)構(gòu)的決定因素尚未得到確定。Guttman等采用HDX-MS首次研究并報道了一組廣泛中和抗體(Broadly neutralizing antibodies,bNAbs)和native-like Env三聚體之間的相互作用(SOSIP.664三聚體)。如圖5所示，VRC01 (IC50=0.32 μg·mL-1)和b12(IC50=2.82 μg·mL-1)都是識別CD4結(jié)合位點(CD4 binding site,CD4bs)的抗體，高特異性VRC01 Fab只在其結(jié)合界面產(chǎn)生局部效應(yīng)，而低特異性b12 Fab結(jié)合則與整個三聚體的復(fù)雜變化有關(guān)(結(jié)合界面顯示為綠色)。結(jié)果表明，弱效的抗體只能在三聚體短暫的開放狀態(tài)下結(jié)合[100]。不僅如此，HDX-MS技術(shù)還可以研究單個抗體與蛋白復(fù)合物的結(jié)合機制或是多個抗體與單個抗原的作用機制。VHH6是一種識別IL-6-gp80復(fù)合物但不單獨識別單個蛋白亞基的抗體，Adams等利用HDX-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)VHH6的CDR區(qū)域與IL-6和gp80同時相互作用，將兩者鎖定在一起，這一結(jié)果為篩選和結(jié)構(gòu)輔助藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的視角[101]。Zhang等則采用HDX研究4個非競爭性抗體單獨或聯(lián)合使用對天然花粉過敏原蛋白(Bet v1)的作用機制。HDX結(jié)果表明，4種抗Bet v1抗體保護(hù)了Bet v1的特定區(qū)域，從而解釋了單克隆抗體與多克隆抗體IgEs結(jié)合Bet v1阻斷效率的差異。作者首次應(yīng)用HDX闡明了聯(lián)合抗體與單獨抗體治療Bet v1誘導(dǎo)過敏的優(yōu)勢，為后續(xù)藥物設(shè)計提供了新思路[102]。

圖5 靶向CD4bs的bNAb結(jié)合的影響[100]

3 總結(jié)與展望

盡管HDX-MS技術(shù)在國外藥物研發(fā)流程中廣泛應(yīng)用，但受技術(shù)細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)解析、重現(xiàn)性等多因素的限制，目前HDX-MS在國內(nèi)生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用還較少。因此，建立規(guī)范化的、具有行業(yè)共識的實驗流程和方案，進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)自動解析度，建立蛋白質(zhì)動態(tài)信息中央HDX數(shù)據(jù)庫是全面推廣HDX-MS技術(shù)的關(guān)鍵。此外，串聯(lián)酶柱、液相-氣相分離技術(shù)的結(jié)合以及與ETD/ECD解離多種技術(shù)的串聯(lián)應(yīng)用也將是未來提升HDX-MS結(jié)構(gòu)信息分辨率的發(fā)展趨勢。而在此基礎(chǔ)上，采用針對性開發(fā)的統(tǒng)計學(xué)方法從HDX數(shù)據(jù)中提取出保護(hù)因子(Protection factor)則有望全面實現(xiàn)HDX-MS技術(shù)的單氨基酸分辨率[103]。而氣相或是在電噴霧界面發(fā)生的HDX-MS將拓展我們對蛋白側(cè)鏈氫如何參與氫鍵和鹽橋作用，穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。最后，HDX-MS與其他生物質(zhì)譜技術(shù)如交聯(lián)質(zhì)譜(Cross-linking mass spectrometry，CX-MS)[104]、非變性質(zhì)譜(Native mass spectrometry)[105]和共價標(biāo)記質(zhì)譜(Covalent labeling mass spectrometry,CL-MS)[106]聯(lián)用，也同樣將拓展和加深我們對蛋白質(zhì)/蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)和動態(tài)信息的認(rèn)識，為靶向藥物設(shè)計提供結(jié)構(gòu)和方法學(xué)基礎(chǔ)。