游雪嬌，袁必鋒，馮鈺锜

(武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072)

核酸(DNA和RNA)中除了包括經(jīng)典堿基，即腺嘌呤(Adenine，A)、鳥嘌呤(Guanine，G)、胞嘧啶(Cytosine，C)、胸腺嘧啶(Thymine，T)和尿嘧啶(Uracil，U)外，還包含許多化學(xué)修飾[1-3]。這些化學(xué)修飾不改變核酸的序列，但會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和生化特性，最終調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)[1-2,4]。

DNA胞嘧啶甲基化(5-Methyl-2′-deoxycytidine，5-mdC)是基因組DNA中研究最為廣泛的一種表觀遺傳修飾，研究證明5-mdC涉及調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育等多種重要生理功能[5]。近年來，在基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了越來越多的修飾[6]。最近的研究表明，TET(Ten eleven translocation)蛋白能夠轉(zhuǎn)化5-mdC生成5-Hydroxymethyl-2′-deoxycytidine(5-hmdC)、5-Formyl-2′-deoxycytidine(5-fdC)，最后轉(zhuǎn)化為5-Carboxyl-2′-deoxycytidine(5-cadC)[7-8]。除DNA胞嘧啶甲基化外，還在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了DNA腺嘌呤甲基化(N6-Methyl-2′-deoxyadenine，6mA)[9-10]。與5-mdC類似，DNA中的這些新修飾在多種生理過程的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[11]。

RNA是將DNA遺傳信息與蛋白質(zhì)聯(lián)系起來的中間分子。鑒于DNA修飾的重要調(diào)節(jié)作用，最近對(duì)RNA可逆修飾的發(fā)現(xiàn)開啟了真核生物轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的新時(shí)代[12]。細(xì)胞RNA中目前發(fā)現(xiàn)了超過150種結(jié)構(gòu)不同的修飾類型[13-14]，其中大多數(shù)修飾是動(dòng)態(tài)、可逆的，可調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響基因的時(shí)空表達(dá)[15]。

DNA和RNA修飾在體內(nèi)的豐度通常極低[16-17]。如哺乳動(dòng)物mRNA中N3-Methylcytidine的含量可以低至每百萬個(gè)核苷僅含幾個(gè)修飾[18]。因此，高靈敏和特異的檢測(cè)方法對(duì)于剖析這些修飾的功能至關(guān)重要。新技術(shù)的發(fā)展在很大程度上促進(jìn)和改變了表觀遺傳修飾領(lǐng)域。質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)因具有高的靈敏度和選擇性，已成為最突出的核酸修飾分析技術(shù)之一[19-28]。然而，直接質(zhì)譜分析對(duì)低豐度核酸修飾的鑒定和分析仍存在一些不足。

化學(xué)衍生能夠改變分析物的化學(xué)和物理性質(zhì)，與質(zhì)譜分析相結(jié)合可以改善分析對(duì)象的色譜分離和提高電噴霧電離(Electrospray ionization,ESI)-MS分析過程中的電離效率，最終提高分析物的檢測(cè)性能[29-33]。在過去的幾年中，本課題組以及其他研究者開發(fā)了多種基于化學(xué)衍生-質(zhì)譜分析的方法對(duì)DNA和RNA修飾進(jìn)行高靈敏和選擇性分析。本文總結(jié)了通過化學(xué)衍生-質(zhì)譜分析方法破譯核酸修飾的最新進(jìn)展，討論了這些分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提供利用這些技術(shù)解決生物和臨床樣本中核酸修飾分析的典型例子。

1 基于化學(xué)衍生-質(zhì)譜技術(shù)的核酸修飾分析

在過去的幾年中，化學(xué)衍生與質(zhì)譜分析相結(jié)合的策略在很大程度上改善了DNA和RNA修飾的檢測(cè)，并促進(jìn)了這些修飾的功能研究。本文基于分析衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜平臺(tái)，對(duì)化學(xué)衍生-質(zhì)譜技術(shù)分析核酸修飾的方法進(jìn)行如下分類：化學(xué)衍生結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、化學(xué)衍生結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry,MALDI-MS)和化學(xué)衍生結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)(圖1)。本文討論并總結(jié)了不同方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性。

圖1 化學(xué)衍生化-質(zhì)譜分析核酸修飾的原理圖

1.1 化學(xué)衍生-LC-MS

1.1.1 DNA修飾除A，C，T，G和5-mdC之外，5-hmd因其重要的生理功能，被視為哺乳動(dòng)物基因組的第6個(gè)堿基[34]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA中的5-hmdC含量低，LC-MS對(duì)5-hmdC的定量分析常受到高豐度正常核苷的離子抑制。為解決該問題，本課題組建立了一種新方法：使用T4β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶選擇性地將葡糖基標(biāo)記到5-hmdC的羥甲基中，形成更親水的產(chǎn)物，即β-Glucosyl-5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine(5-gmdC)[35]。在進(jìn)行LC-MS分析前，通過NH2-二氧化硅的親水相互作用選擇性地富集5-gmdC，從而消除正常核苷的離子抑制，顯著提高了對(duì)5-hmdC的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。利用已建立的方法，在3種培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和7種酵母菌株的基因組DNA中鑒定了5-hmdC修飾。

為了對(duì)植物DNA中可能存在的低含量5-fdC和5-cadC進(jìn)行靈敏和定量分析，本課題組采用吉拉德試劑(吉拉德D、吉拉德T和吉拉德P)對(duì)5-fdC和5-cadC進(jìn)行衍生化。吉拉德試劑含有易電離的叔胺或季銨，且能同時(shí)與5-fdC的醛基和5-cadC的羧基在溫和條件下反應(yīng)(圖2)[36]。通過建立的高靈敏度檢測(cè)方法，在擬南芥和水稻基因組DNA中鑒定發(fā)現(xiàn)了5-fdC和5-cadC。此外，還發(fā)現(xiàn)干旱和鹽的環(huán)境脅迫可改變水稻基因組中5-fdC和5-cadC的含量，表明5-fdC和5-cadC在對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)中起重要作用。但由于5-fdC和5-cadC的衍生化是依次進(jìn)行的，這使得分析過程相對(duì)較為復(fù)雜?；谙嗨频脑恚琀ong等[37]通過含有季銨基團(tuán)的吉拉德T試劑衍生來測(cè)定DNA中的5-Formyl-2′-deoxyuridine(5-fdU)。衍生化與LC-MS分析結(jié)合使5-fdU的檢出限(Limits of detection,LOD)達(dá)到3～4 fmol，這比直接質(zhì)譜分析5-fdU的靈敏度提高了約20倍。

圖2 吉拉德試劑衍生化結(jié)合LC-MS分析方法測(cè)定植物基因組DNA中5-fdC和5-cadC的示意圖[36]

5-mdC及其氧化產(chǎn)物(5-hmdC、5-fdC和5-cadC)在DNA中的豐度差別很大，對(duì)這些胞嘧啶修飾進(jìn)行同時(shí)定量檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性。鑒于此，本課題組建立了2-Bromo-1-(4-dimethylaminophenyl)-ethanone(BDAPE)衍生結(jié)合LC-MS的分析方法，用于同時(shí)高靈敏測(cè)定4種胞嘧啶修飾(5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC)[38]。衍生試劑BDAPE易與胞嘧啶的N3和N4位置反應(yīng)，形成穩(wěn)定的五元環(huán)結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)這4種胞嘧啶修飾的同時(shí)衍生化。BDAPE含有一個(gè)疏水性的苯基和一個(gè)易帶電的叔銨基，衍生化后能顯著改善這些胞嘧啶修飾的液相色譜分離，并能顯著提高它們的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。經(jīng)BDAPE衍生化后，這些胞嘧啶修飾的檢測(cè)靈敏度提高了35～123倍。利用此方法，成功定量了結(jié)直腸患者癌癥組織和癌旁組織中的5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，人的結(jié)直腸癌組織中5-hmdC、5-fdC和5-cadC的含量顯著降低，表明這些修飾在癌癥形成中具有潛在作用，這些修飾的減少可能是結(jié)直腸癌患者的一個(gè)普遍特征，暗示胞嘧啶修飾可作為早期診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。由于鹽能夠造成胞嘧啶修飾的BDAPE衍生化效率降低，因此需通過固相萃取(Solid phase extraction,SPE)純化酶解消化的核苷從而去除鹽對(duì)衍生化反應(yīng)的影響。

除BDAPE衍生化外，Guo等[39]最近使用4-(二甲基氨基)苯甲酸酐同時(shí)衍生DNA中4個(gè)胞嘧啶修飾(5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC)的氨基，LODs為1.2～2.5 fmol。通過建立的方法，發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中5-fdC和5-cadC的含量比相鄰的正常組織高。8-Nitroguanine(8-nitroG)是由過氧亞硝酸鹽在炎癥過程中產(chǎn)生的主要核酸損傷，是一種可評(píng)估炎癥相關(guān)癌變的潛在生物標(biāo)志物。最近，Hu等[40]開發(fā)了一種6-Methoxy-2-naphthyl glyoxal hydrate(MTNG)衍生化結(jié)合在線SPE/LC-MS的策略分析8-nitroG。8-nitroG經(jīng)MTNG衍生化后，通過在線SPELC-MS分析，檢測(cè)靈敏度提高約10倍。該方法用于定量測(cè)定8-nitroG的靈敏度高、可靠性好，可用于實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，以了解炎癥相關(guān)DNA損傷與癌變之間的關(guān)系。此外，由于MTNG可與8-nitroG以及其他鳥嘌呤化合物反應(yīng)，因此需加入過量的MTNG并在質(zhì)譜分析之前通過SPE除去過量的MTNG。

最近，Yu等[41]提出一類基于肼的衍生化試劑用于高靈敏分析胞嘧啶修飾。這類衍生化試劑含有一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)肼基，以及一個(gè)疏水三嗪基和兩個(gè)易帶電荷的叔胺基用于調(diào)節(jié)衍生產(chǎn)物的疏水性。篩選出的基于肼的試劑能同時(shí)與5-fdC和5-cadC快速反應(yīng)，使5-fdC和5-cadC的檢測(cè)靈敏度分別提高了125倍和100倍。使用該方法，5-fdC和5-cadC的LODs可低至10 amol和25 amol，實(shí)現(xiàn)了兩者的高靈敏定量檢測(cè)，該方法用600 ng基因組DNA便可同時(shí)檢測(cè)不同組織中的5-fdC和5-cadC，為珍貴樣品中5-fdC和5-cadC的分析提供了有效方法。

此外，Zhou等[42]使用氰基磷葉立德試劑(YC-CN)建立了一種有效的5-fdC衍生化方法，該方法利用YC-CN與5-fdC上醛基的Wittig反應(yīng)，提出了一種基于光輔助三重多米諾反應(yīng)策略，不僅能對(duì)5-fdC快速檢測(cè)，還能實(shí)現(xiàn)5-fdC和5-fdU的區(qū)分。通過該策略，能準(zhǔn)確定量由γ輻射形成的5-fdC，表明該方法具有顯著的選擇性和敏感性。YC-CN的高反應(yīng)活性和高效的光催化策略使其成為5-fdC的快速衍生化方法。這種Wittig啟動(dòng)的共價(jià)標(biāo)記策略為5-fdC的定性和定量檢測(cè)提供了一種新策略。此外，該研究也為從反應(yīng)機(jī)理的角度區(qū)分5-fdC和5-fdU提供了新的思路。

1.1.2 RNA修飾除了氧化DNA中5-mdC生成5-hmdC，TET蛋白還可以催化RNA中的5-Methylcytidine(5-mrC)形成5-Hydroxymethylcytidine(5-hmrC)[43]。為探索RNA中5-hmrC的進(jìn)一步氧化產(chǎn)物5-Formylcytidine(5-frC)，本課題組開發(fā)了氧化衍生化與質(zhì)譜相結(jié)合的策略(Oxidation-derivatization combined with MS,ODMS)[44]。該策略使用MnO2將5-hmrC氧化成5-frC，產(chǎn)生的5-frC進(jìn)一步用丹磺酰肼衍生化。5-frC中的醛基可以很容易與丹磺酰肼中的酰肼反應(yīng)，產(chǎn)生具有易帶電的叔銨腙衍生物，從而能夠在LC-MS分析中提高5-frC的電離效率(圖3)。通過ODMS策略發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA中存在5-frC。定量結(jié)果顯示RNA中5-frC的含量在HeLa細(xì)胞中為(9.0±1.2)/106rG，在HEK293T細(xì)胞中為(8.5±1.4)/106rG。此外，本課題組建立了2-Bromo-1-(4-diethylaminophenyl)-ethanone(BDEPE)衍生化與LC-MS相結(jié)合的分析方法，用于高靈敏和同時(shí)測(cè)定RNA中5-mrC的氧化產(chǎn)物[45]。結(jié)果表明，經(jīng)BDEPE衍生化后，RNA中5-mrC、5-hmrC、5-frC和5-Carboxylcytidine(5-carC)的檢測(cè)靈敏度提高了70～313倍。使用該方法發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物RNA中存在5-carC。此外，還發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，人結(jié)直腸癌組織和肝細(xì)胞癌組織中5-hmrC的含量顯著降低，表明RNA中5-hmrC在調(diào)控腫瘤的發(fā)生和形成中可能發(fā)揮一定作用。另外，使用建立的高靈敏分析方法探索了環(huán)境重金屬污染物(砷、鎘、鉻和銻)對(duì)核酸修飾的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞DNA中的5-hmdC、5-fdC、5-cadC和RNA中5-hmrC、5-frC、5-carC的含量在重金屬處理后顯著降低，暗示重金屬可造成表觀遺傳修飾紊亂的新毒性機(jī)制[46]。

除化學(xué)衍生/LC-MS分析外，本課題組最近建立了一種吉拉德P試劑衍生化與管內(nèi)固相微萃取以及LC-MS相結(jié)合的分析策略，用于高靈敏測(cè)定醛基化DNA和RNA修飾(圖4)[47]。攜帶負(fù)電的羧基填料可富集帶正電荷的衍生物，從而消除高豐度正常核苷的干擾，提高醛基化DNA和RNA修飾分析的檢測(cè)性能。使用該方法同時(shí)檢測(cè)了6種醛基化核苷，包括來自培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和多種哺乳動(dòng)物組織DNA中的5-fdC和5-fdU，以及RNA中的5-frC、5-Formyluridine(5-frU)、2'-O-methyl-5-formylcytidine(5-frCm)和2'-O-Methyl-5-formyluridine(5-frUm)。該方法使醛基化核苷的檢測(cè)靈敏度提高了307～884倍。這是首次在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)5-frU、5-frCm和5-frUm。此外，還觀察到人甲狀腺癌組織RNA中的5-frC和5-frU以及DNA中的5-fdU的表達(dá)比癌旁組織高。結(jié)果顯示異常的DNA和RNA醛基化修飾可能參與腫瘤的形成和發(fā)展，同時(shí)暗示了DNA和RNA的醛基化修飾也可作為癌癥診斷的指標(biāo)。但該方法需制備攜帶負(fù)電的填料，分析較為繁瑣，可能限制其在不同實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用。

圖3 氧化衍生化結(jié)合LC-MS分析方法測(cè)定DNA中5-hmdC、5-fdC和RNA中5-hmrC、5-frC的示意圖[44]

圖4 吉拉德P試劑衍生化結(jié)合管內(nèi)固相微萃取和LC-MS/MS分析方法測(cè)定DNA和RNA醛基化修飾示意圖[47]

與ESI-MS一樣，電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)也是核酸修飾研究中的有益工具。Wrobel等[48]提出了一種基于LC-ICP-MS靈敏檢測(cè)RNA中5-mrC的策略。該策略依賴于通過在順式二羥基核糖基團(tuán)、鋨酸鉀(Ⅵ)二水合物(K2OsO2(OH)4)和四甲基乙二胺之間形成三元復(fù)合物在核糖上衍生鋨(Os)。該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)5-mrC的靈敏分析，其LOD可達(dá)21 pmol/L。

1.1.3 游離核苷/核苷酸修飾檢測(cè)生物體中的內(nèi)源性修飾核苷可作為一種非侵入性的疾病診斷方法。為了實(shí)現(xiàn)生物體中修飾核苷的全面分析，本課題組建立了金屬氧化物分散SPE，隨后進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記和雙中性丟失掃描質(zhì)譜分析方法[49]。CeO2常被用于復(fù)雜生物樣品中核糖綴合物的選擇性捕獲[50-51]。富集的核苷可用丙酮和丙酮-D6進(jìn)行衍生化，丙酮和丙酮-D6的衍生化產(chǎn)物在相同條件下被電離，但在質(zhì)譜上單獨(dú)記錄，這可以顯著提高檢測(cè)特異性并促進(jìn)對(duì)修飾核苷的鑒定。使用該方法在人尿液中鑒定出49種核糖綴合物，其中7種核糖綴合物的含量在健康組和淋巴瘤患者之間表現(xiàn)出明顯差異[49]，為尿液中修飾核苷的有效分析奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)為尿液中修飾核苷作為癌癥指標(biāo)的應(yīng)用提供了準(zhǔn)確結(jié)果。此外，Li等[52]使用類似的策略鑒定了尿液樣本中的52種修飾核苷。由于該分析策略取決于攜帶順式二羥基的核糖核苷的富集，因此不能富集和檢測(cè)2'-O-甲基化核苷。

除甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DNA和RNA甲基化外，甲基化的核苷酸可能在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中潛在地?fù)饺隓NA和RNA中。為了探索內(nèi)源修飾核苷酸的存在，本課題組建立了N,N-二甲基對(duì)苯二胺(N,N-Dimethsyl-p-phenylenediamine，DMPA)衍生化與LC-MS結(jié)合的方法，可同時(shí)高靈敏測(cè)定5-Methyl-2'-deoxycytidine monophosphate(5-Me-dCMP)和5-Methylcytidine monophosphat(5-Me-CMP)等10種核苷酸(圖5)[53]。經(jīng)過DMPA衍生化后，核苷酸的檢測(cè)靈敏度增加了88～372倍。采用該方法發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的5-Me-dCMP和5-Me-CMP廣泛存在于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人組織和尿樣中。此外，還發(fā)現(xiàn)腎癌組織和淋巴瘤患者尿液中5-Me-dCMP和5-Me-CMP的含量與正常人相比明顯降低，暗示修飾核苷酸對(duì)癌癥基因異常調(diào)控具有潛在的作用。最近，本課題組進(jìn)一步建立了8-(重氮甲基)喹啉衍生化結(jié)合LC-MS的分析方法，用于測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中內(nèi)源性修飾的核苷三磷酸(Nucleoside triphosphates,NTP)(圖6)[54]。結(jié)果顯示，合成的8-(重氮甲基)喹啉可在溫和條件下與NTP的磷酸基團(tuán)有效反應(yīng)，所建立的方法能實(shí)現(xiàn)NTP的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度提高了56～137倍。通過該方法，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中鑒定了12種內(nèi)源性修飾的NTP。此外，與癌旁組織相比，這些修飾的NTP在人肝細(xì)胞癌組織中的含量明顯降低。這些研究揭示了真核生物中廣泛存在修飾的NTP，為DNA和RNA的修飾提供了新來源。由于重氮基易降解，8-(重氮甲基)喹啉的穩(wěn)定性較差，因此在進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)需要注意。

圖5 DMPA標(biāo)記單磷酸核苷酸示意圖[53]

圖6 8-(重氮甲基)喹啉標(biāo)記三磷酸核苷酸示意圖[54]

1.2 化學(xué)衍生-MALDI-MS

Pseudouridine(Ψ)是U的一種異構(gòu)化修飾，也是RNA中的一種質(zhì)量沉默修飾，難以通過常規(guī)的質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行識(shí)別。為了解決該問題，Patteson等[55]開發(fā)了一種1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide,CMC)衍生化方法，結(jié)合MALDI-MS分析，用于測(cè)定RNA中的Ψ。在CMC衍生化之后，每個(gè)Ψ有252 Da的質(zhì)量增加，可通過MALDI-MS進(jìn)行分析鑒定。為確定Ψ的序列位置，可將CMC衍生化前后的產(chǎn)物RNase T1消化后進(jìn)行MALDI-MS分析。然而，由于CMC也能夠標(biāo)記其它尿苷，這對(duì)分析含有許多尿苷殘基的RNA是不利的。該課題組通過優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值和CMC與樣品的比例來改善CMC衍生化條件[56]。在優(yōu)化的衍生化條件下，可降低由于不完全衍生化造成的假陽性。此外，這種方法還可為含有Ψ的特定小RNA提供信息[57]。

研究表明，Ψ中的N1位置處可被特異性氰乙基化[58]。與CMC衍生化相比，Ψ可以完全氰乙基化，而正常尿苷僅被標(biāo)記約5%。這種方法能實(shí)現(xiàn)Ψ的一步衍生化，并且避免了對(duì)RNA骨架的破壞。Mengel-Jorgensen等[59]使用該衍生化策略并結(jié)合MALDI-MS分析了tRNA中的Ψ。Ψ的氰乙基化會(huì)產(chǎn)生53 Da的質(zhì)量增加，因此很容易通過MALDI-MS檢測(cè)。通過該策略，研究者成功地鑒定了來自大腸桿菌的tRNATyrII中的一個(gè)Ψ位點(diǎn)。MALDI-MS與氰乙基化的組合成為基于質(zhì)譜檢測(cè)Ψ的有效方法[59]。

1.3 化學(xué)衍生-GC-MS

氣相色譜-質(zhì)譜被廣泛用于痕量化合物的測(cè)定。然而，DNA和RNA修飾不是揮發(fā)性的，不能通過GC-MS直接分析。因此，化學(xué)衍生化通常用于在GC-MS分析前將堿基/核苷轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物。

Singer等[60]開發(fā)了一種檢測(cè)小牛胸腺、鮭魚精子和幾種小鼠組織的基因組DNA中5-Methylcytosine(5-mC)的方法。使用88%甲酸在180 ℃下將DNA水解成堿基，然后用雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis-(Trimethylsilyl)-trifluoroacetamide,BSTFA)衍生化堿基,得到的C和5-mC的衍生物可以很容易地被分離，且不會(huì)干擾其他正常堿基,該方法能檢測(cè)到DNA中低至1.6 pmol的5-mC。之后，Romerio等[61]引入了[2-13C]5-mC和[2-13C]C兩個(gè)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，提供了基因組DNA中5-mC更準(zhǔn)確的定量。該方法成功應(yīng)用于外周血單核細(xì)胞DNA中5-mC的檢測(cè)。

本課題組采用GC-MS開發(fā)了一種用于研究酵母基因組DNA中5-mC[62]的高靈敏度分析方法，用88%甲酸水溶液在140 ℃下將提取的DNA水解成嘌呤和嘧啶，然后使用BSTFA和三甲基氯硅烷在乙腈中進(jìn)行衍生化，5-mC的LOD達(dá)到0.8 pg(6.4 fmol)。并通過該方法，在19種酵母菌株中鑒定了5-mC，含量為0.014%～0.364%，表明酵母基因組中廣泛存在DNA胞嘧啶甲基化修飾。

2 結(jié)論與展望

最近的研究進(jìn)展證明DNA和RNA修飾是動(dòng)態(tài)、可逆的，這些修飾增加了核酸的多樣性，更重要的是，增加了生理過程中新的調(diào)節(jié)因子。對(duì)DNA和RNA修飾的功能研究為深入理解疾病的分子機(jī)制提供了有價(jià)值的信息，新技術(shù)和新方法的快速發(fā)展也極大地推動(dòng)了核酸修飾的研究。

設(shè)計(jì)和使用適當(dāng)?shù)难苌噭┮詫?shí)現(xiàn)快速、高效和特異性衍生目標(biāo)修飾對(duì)于將來探索核酸修飾的功能是非常重要的。但是基于化學(xué)衍生-質(zhì)譜分析的方法也存在一定局限性，如副產(chǎn)物的形成和過量衍生化試劑引起的新問題。因此，仍需開發(fā)新的衍生化試劑和衍生化反應(yīng)，以便通過質(zhì)譜進(jìn)行高靈敏和選擇性地檢測(cè)核酸修飾。通過分析DNA和RNA修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)可為設(shè)計(jì)合適的衍生化試劑提供有用的指導(dǎo)。新衍生化試劑和衍生化反應(yīng)的發(fā)展可能會(huì)有助于發(fā)現(xiàn)新的DNA和RNA修飾，這也將為核酸修飾與疾病相關(guān)研究提供新線索。除了破譯核酸修飾外，化學(xué)衍生與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合還可以擴(kuò)展到如蛋白質(zhì)組學(xué)研究、代謝組學(xué)研究和質(zhì)譜成像等各種研究領(lǐng)域。