賀 莉 ， 冉 毅 ，李冰峰

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站， 北京 100125)

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，畜禽廢棄物年排放量為134億t，農(nóng)作物秸稈年達(dá)5億t(干重)[1]，給生態(tài)環(huán)境造成巨大壓力。厭氧發(fā)酵是處理畜禽養(yǎng)殖糞污和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物的重要手段，通過(guò)水解、酸化和產(chǎn)甲烷3個(gè)階段將廢棄物中的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為清潔能源和植物易于吸收的有機(jī)肥。這3個(gè)階段中，酸化階段是制約厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟，尤為重要。一方面，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣量依賴(lài)于產(chǎn)甲烷菌持續(xù)不斷將產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸濃度(VFAs)轉(zhuǎn)化為甲烷，另一方面，當(dāng)厭氧反應(yīng)器中累計(jì)VFAs濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的活躍程度甚至造成厭氧發(fā)酵體系的崩潰，因此定期監(jiān)測(cè)厭氧反應(yīng)器中的VFAs濃度，是掌控厭氧反應(yīng)器運(yùn)行狀況的重要手段。目前VFAs的國(guó)際通用檢測(cè)方法是高效液相色譜法(HPLC)和氣象色譜法(GC)。厭氧發(fā)酵體系背景復(fù)雜，采用色譜法檢測(cè)前，需要酸化、離心、過(guò)濾等預(yù)處理手段，尤其是采用GC法測(cè)定甲酸時(shí)，還需要進(jìn)行衍生化處理，導(dǎo)致前處理過(guò)程復(fù)雜，大大增加檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。使用HPLC時(shí)，預(yù)處理后的上清液中依然混有醇、酸、酯、蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)，均需要頻繁更換保護(hù)柱，避免造成色譜柱堵塞，檢測(cè)成本高；不計(jì)預(yù)處理時(shí)間，HPLC一次檢測(cè)時(shí)間為25～30 min，耗時(shí)費(fèi)力；尤其是分離丁酸和異丁酸這種同分異構(gòu)體時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)相近，存在色譜峰重疊，常規(guī)C18柱無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，導(dǎo)致VFAs定量不準(zhǔn)確。近紅外(near infrared, NIR)光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)是一種易于操作、低成本的快速檢測(cè)方法，可替代傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析用于定性和定量分析。目前近紅外被廣泛用于食品[2]、農(nóng)產(chǎn)品和藥品的成分鑒定[3]，以及特色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地辨別[4]。近紅外光譜技術(shù)與厭氧發(fā)酵結(jié)合緊密，被用于有機(jī)廢棄物生化產(chǎn)甲烷潛力預(yù)測(cè)[5]，實(shí)時(shí)監(jiān)控?fù)]發(fā)性脂肪酸含量[6]。目前關(guān)于NIRS法分析沼液中丁酸和異丁酸的分離研究在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用近紅外光譜儀掃描樣本，建立快速、便捷的近紅外光譜定量分析模型預(yù)測(cè)樣品中丁酸和異丁酸濃度；對(duì)光譜進(jìn)行波段篩選和算法優(yōu)化，有效提高丁酸和異丁酸模型定量的準(zhǔn)確度，為VFAs的準(zhǔn)確定量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品收集與制備

實(shí)驗(yàn)室用超純水配置丁酸和異丁酸不同的濃度的單標(biāo)樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品27個(gè)，其中18個(gè)作為訓(xùn)練集，用于建立近紅外光譜模型；9個(gè)作為測(cè)試集，用于驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

1.2 光譜采集與處理

實(shí)驗(yàn)采用Bruker MPA多功能型傅立葉變換近紅外光譜儀，帶漫反射積分球附件。光譜范圍780～2500 nm,掃描次數(shù)64次，分辨率為16 cm-1。在室溫(20℃～22℃)環(huán)境下，將溶液倒入玻璃樣品杯，每個(gè)樣品分別裝填3次，分別掃描后取各樣品光譜的均值。

1.3 化學(xué)分析

配置的丁酸和異丁酸用于GC建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用外標(biāo)法對(duì)混合樣品中丁酸和異丁酸檢測(cè)通過(guò)GC定量分析。每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣測(cè)定，取平均值。

1.4 NIRS數(shù)學(xué)模型的建立方法

本研究采用偏最小二乘回歸(Partial Least Square Regression, PLSR)算法對(duì)近紅外光譜數(shù)據(jù)建立回歸模型，利用混合樣本的近紅外光譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)其中的丁酸、異丁酸含量的定量分析。PLSR作為經(jīng)典的多元校正方法，已廣泛應(yīng)用于近紅外光譜的定量分析中[7]，其算法的主要思想是在主成分分析的基礎(chǔ)上，不僅對(duì)混合物的光譜量測(cè)矩陣Y進(jìn)行正交分解，獲取其主成分T(T = {ti}, i = 1, 2, 3, …, m)，同時(shí)還將濃度矩陣C也進(jìn)行分解，得到其主成分R(R = {rj}, j = 1, 2, 3, …, p)。

Y=USVt+E=TVt+E

(1)

C=PGQt+E=RQt+E

(2)

其中E為殘差。最終預(yù)測(cè)模型利用最小二乘原理，建立矩陣T和R之間的線(xiàn)性關(guān)系：

R=BC

(3)

其中B為回歸系數(shù)矩陣。在本研究中，偏最小二乘回歸的建模與預(yù)測(cè)過(guò)程，均在MATLAB(R2016b, version 9.1.0)中完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁酸和異丁酸溶液實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析結(jié)果

為準(zhǔn)確定量丁酸和異丁酸濃度，配置丁酸和異丁酸比例從10%～90%，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)沼液中丁酸和異丁酸的實(shí)際樣品濃度，控制混標(biāo)總濃度為200 mg·L-1。為準(zhǔn)確定量配置溶液濃度，分別配置丁酸和異丁酸單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用外標(biāo)法對(duì)配置濃度進(jìn)行校正。設(shè)置序號(hào)為1,2,4,5,7,9的樣品為訓(xùn)練集，通過(guò)其濃度測(cè)試建立PLSR 模型；將3,6,8的樣品設(shè)定為測(cè)試集，用于濃度預(yù)測(cè)。溶液配置濃度比和實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)值見(jiàn)表1。

表1 不同混合溶液中丁酸、異丁酸的配比

2.2 溶液樣品的近紅外光譜

根據(jù)表1中丁酸和異丁酸的混標(biāo)，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)9個(gè)樣本，每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的測(cè)試，此最終獲得27份混合樣品，如圖1所示。從圖中可知，不同濃度的混標(biāo)樣品的平均光譜吸收峰的位置大致相同，集中在4500 nm～8000 nm，不同濃度混標(biāo)的吸光值迥異。

圖1 27份丁酸、異丁酸混合溶液的近紅外光譜

2.3 丁酸和異丁酸的NIRS模型

將平行樣本的光譜進(jìn)行平均，獲得各平行樣本的平均光譜，隨后將3，6，8號(hào)樣本留作獨(dú)立測(cè)試集，對(duì)PLSR模型進(jìn)行檢驗(yàn)，其余混合樣本作為訓(xùn)練集構(gòu)建PLSR模型。對(duì)于丁酸與異丁酸，筆者分別建立PLSR模型對(duì)其含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，模型采用前5個(gè)PLS潛變量進(jìn)行回歸建模，實(shí)驗(yàn)設(shè)定的丁酸、異丁酸含量與預(yù)測(cè)結(jié)果的相關(guān)性如圖2和圖3所示。

圖2 訓(xùn)練集與獨(dú)立測(cè)試集中丁酸實(shí)際含量與預(yù)測(cè)值比較

圖3 訓(xùn)練集與獨(dú)立測(cè)試集中異丁酸的實(shí)際含量與預(yù)測(cè)值比較

從圖2和圖3可以看出，測(cè)試集中的丁酸、異丁酸含量的預(yù)測(cè)值與其實(shí)際含量的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，表明模型可以很好的對(duì)混合樣本中兩種揮發(fā)酸的含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖4和圖5顯示了模型的預(yù)測(cè)誤差，包括均方根誤差(Root Mean Square Error, RMSE)以及平均絕對(duì)百分比誤差(Mean Absolute Percentage Error, MAPE)。對(duì)于測(cè)試集來(lái)說(shuō)，模型在預(yù)測(cè)丁酸、異丁酸的含量時(shí)，RMSE均為3.862%，MAPE小于9%，該預(yù)測(cè)誤差在厭氧發(fā)酵體系的丁酸、異丁酸含量檢測(cè)中，可滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用的需求。

圖4 訓(xùn)練集與獨(dú)立測(cè)試集中模型對(duì)于丁酸含量的預(yù)測(cè)誤差

圖5 訓(xùn)練集與獨(dú)立測(cè)試集中模型對(duì)于異丁酸含量的預(yù)測(cè)誤差

3 結(jié)論

近紅外光譜技術(shù)可用于厭氧發(fā)酵體系中丁酸和異丁酸的定量分析研究，具有較好的適用性。外部驗(yàn)證丁酸和異丁酸濃度與近紅外光譜預(yù)測(cè)值非常接近，RMSE均為3.862%，MAPE小于9%，具有良好的預(yù)測(cè)性。下一步將針對(duì)總揮發(fā)酸中每一種揮發(fā)酸建立模型，以期早日用于真實(shí)樣品的測(cè)試，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)費(fèi)用。