陸 謙, 朱李瑢, 程 欣, 黃 華, 陳 鐘

1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院 a.肝膽外科； b.病理科， 江蘇 南通 226001；2 南通市通州區(qū)人民醫(yī)院 普外科， 江蘇 南通 226300

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌是全球第6大常見的癌癥并且是第4大癌癥死亡的原因[1]。肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的原發(fā)性肝癌類型，占總發(fā)病人數(shù)的75%～85%[1-2]。目前研究[3-4]表明，基因的異常表達(dá)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，并且針對某些異常表達(dá)基因的靶點治療是未來肝癌精準(zhǔn)治療的方向。蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體的功能為癌癥治療提供了獨特的方法[5]。人蛋白酶體β亞基4型(PSMB4)是20S蛋白酶體的一個亞基，被認(rèn)為是第一個具有致癌特性的蛋白酶體亞基，可以促進(jìn)體內(nèi)癌細(xì)胞的存活和腫瘤生長[6]。然而，PSMB4在人類肝癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后關(guān)系尚未被研究。本研究擬檢測PSMB4在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)情況與肝癌患者臨床病理參數(shù)以及生存時間之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2009年1月-2012年10月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科行肝癌根治性手術(shù)切除患者的臨床及隨訪資料，共有105例肝癌組織及25例正常肝組織進(jìn)行了免疫組化評分。Child-Pugh B級及C級、手術(shù)切緣陽性、術(shù)前有放化療史以及臨床資料不完全的病例排除。隨訪截止時間2018年6月。手術(shù)后至死亡或最后隨訪時間定義為總生存時間。另收集了2017年1月-10月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的8例患者的肝癌及癌旁組織樣本，用于Western Blot分析。所有資料的獲取均獲得了患者的知情同意，實驗流程通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：2018-L006)。

1.2 Western Blot分析 將8例新鮮組織在勻漿緩沖液中勻漿，并在4 ℃、12 000 ×g離心30 min后收集上清液。依據(jù)Bio-Rad法測定蛋白質(zhì)濃度，并調(diào)節(jié)至相同的蛋白濃度。利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉封閉，用含有Tween-20的Tris緩沖鹽水洗滌，加入PSMB4抗體(1∶1000)，抗GAPDH(1∶2000)孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗(1∶500)再次孵育4 h。最后，加入ECS顯色液，顯示與抗體相結(jié)合的蛋白條帶。

1.3 免疫組化染色及評分 將稀釋的PSMB4單克隆抗體(1∶200)均勻滴在包含105例肝癌組織及25例正常肝組織的組織芯片上，4 ℃濕盒中孵育過夜。然后均勻地滴加稀釋的相應(yīng)二抗(1∶100)，室溫放置30 min。接著使用顯微鏡對每個樣本捕獲3個代表性的圖像，并邀請資深的病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲讀片。PSMB4的免疫染色評分為0～9分，并以陽性染色的腫瘤細(xì)胞所占百分比(0～9%，0分；10～25%，1分；26%～50%，2分；>50%，3分)和染色強度(無染色，0分；輕度染色，1分；中度染色，2分；重度染色，3分)的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)?？傇u分>3分定義為PSMB4高表達(dá)組織，總評分≤3分定義為PSMB4低表達(dá)組織。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 105例肝癌患者根據(jù)PSMB4的表達(dá)水平可分為高表達(dá)組(n=57)和低表達(dá)組(n=48)。2組間HBV感染、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度、TNM分期比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 PSMB4表達(dá)情況

2.2.1 免疫組化染色情況 105例肝癌組織中，57例(54.29%)顯示為 PSMB4 高表達(dá)，48例(45.71%)顯示為PSMB4低表達(dá)；而在25例正常肝組織中8例(32%)顯示為PSMB4高表達(dá)，17例(68%)顯示為PSMB4低表達(dá)或不表達(dá)，2組表達(dá)情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.011,P<0.05)。PSMB4染色主要分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，染色呈棕色及棕黃色顆粒樣(圖1)。

表1 肝癌組織中PSMB4的表達(dá)水平與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

注：a，低分化肝癌組織強陽性；b，中分化肝癌組織中陽性；

c，高分化肝癌組織弱陽性；d，正常肝組織陰性。

圖1肝癌及癌旁組織的PSMB4免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.2.2 Western Blot檢測結(jié)果 8例新鮮肝癌及癌旁組織樣本的Western Blot檢測結(jié)果顯示，有7例樣本中肝癌組織的PSMB4蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P值均<0.05)(圖2)。

2.3 Cox風(fēng)險比例模型分析結(jié)果及生存分析 截至隨訪時，105例患者中死亡63例，生存42例。Cox單因素和多因素風(fēng)險回歸模型分析顯示，患者的5年生存狀態(tài)與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、分化程度、TNM分期以及PSMB4表達(dá)水平相關(guān)(P值均<0.05)，其中腫瘤轉(zhuǎn)移和PSMB4高表達(dá)是肝癌患者的獨立危險因素(P值均<0.001)(表2)。

Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步分析顯示，PSMB4高表達(dá)組患者5年生存率明顯低于PSMB4低表達(dá)組(27.6% vs 79.2%,χ2=22.96,P<0.05)(圖3)。

表2 Cox風(fēng)險回歸模型分析肝癌患者5年生存情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：HR,風(fēng)險比；95%CI,95%可信區(qū)間。

3 討論

肝癌是我國第4大常見惡性腫瘤，由于其起病隱匿、轉(zhuǎn)移早，多半患者在臨床確診時已經(jīng)錯過最佳的手術(shù)切除機會[7-8]。目前，以索拉非尼為代表的分子靶向藥物為晚期肝癌的治療提供了一種新手段。但是，索拉非尼除了對癌細(xì)胞起作用外也對正常細(xì)胞產(chǎn)生副作用，所以肝癌的分子治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)[9-10]。因此，深入探究肝癌發(fā)生的分子機制，尋找準(zhǔn)確預(yù)測肝癌發(fā)生和預(yù)后的分子標(biāo)志物，采取及時有效的預(yù)防和治療措施，對肝癌患者的生存時間有著重要的意義。

蛋白酶體是一種多亞基復(fù)合物，可選擇性地降解80%～90%的細(xì)胞內(nèi)蛋白，并參與幾乎所有的細(xì)胞過程[11]。PSMB4即26S蛋白酶體β亞基4型，此基因位于1q21，mRNA為925 bp，含有7個外顯子, 編碼29 kD大小的蛋白，主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中[12]。PSMB4在26S蛋白酶體的20S核心顆粒的生物形成中起穩(wěn)定和成熟的作用，并且在腫瘤細(xì)胞蛋白酶體β亞基上絲氨酸殘基的磷酸化較低，使得它有望成為腫瘤的生物標(biāo)志物[13]。最近研究[12,14-15]發(fā)現(xiàn)PSMB4在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、皮膚黑色素瘤等。本研究也發(fā)現(xiàn)PSMB4在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁及正常肝組織，PSMB4表達(dá)增高的肝癌患者的生存時間少于PSMB4低表達(dá)的患者。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PSMB4表達(dá)水平與最大腫瘤直徑、腫瘤分化和TNM分期有關(guān)，表明PSMB4表達(dá)增高可能促進(jìn)了肝癌的進(jìn)展。不僅如此，根據(jù)先前的研究[16-17]報道，PSMB4的表達(dá)可以在HBV-X基因轉(zhuǎn)染的HL-7702肝細(xì)胞和p21-HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝癌模型中顯著增加。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)PSMB4表達(dá)增高與患者HBV感染情況有關(guān)，因此，推測PSMB4基因在HBV慢性感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生過程中起著重要的推動作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PSMB4的表達(dá)水平與肝癌發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后密切相關(guān)。因此，PSMB4基因有可能成為肝癌治療的潛在靶點和預(yù)后標(biāo)志物。然而，肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個非常復(fù)雜的過程，PSMB4作為一個促癌基因在其中的具體作用機制尚未完全闡明，還有待進(jìn)一步的深入研究。