庫爾班江·阿布都西庫爾 王建設

隨著人民生活水平的改善、病毒性肝炎預防及診治水平的提高，感染性肝病的發(fā)病率逐年下降。近年來生物科技的迅速發(fā)展，越來越多的肝病分子生物基礎得以明確，遺傳性肝病已成為肝病常見的病因之一[1]。1989年囊性纖維化致病基因(CFTR)的發(fā)現開啟了肝病分子機制研究的新篇章。上世紀90年代相繼發(fā)現了高膽紅素血癥(UGT1A1及ABCC2)、肝豆狀核變性(ATP7B)、血色病(HFE)、Alagille綜合征(JAG1)及進行性家族性肝內膽汁淤積癥(ATP8B1、ABCB11及ABCB4)等致病基因[2]?；蛟\斷技術在過去的30年見證了肝病分子機制的巨大突破。近年來國內基因診斷技術快速普及，越來越多的重癥或疑難肝病患者不但得以確診，也受益于針對病因的有效治療措施。本課題組先后在國內首次報道多種進行性家族性肝內膽汁淤積癥(PFIC)[3-5]、Alagille綜合征[6]及膽汁酸合成缺陷[7-8]。2017年及2020年先后首次在國際上報道MYO5B、USP53及ZFYVE19等新基因引起的遺傳性肝病[9-11]。此外，本課題組在國內首次報道了其他罕見遺傳性肝病的新突變或新表型[12-19]。本文將闡述肝病基因診斷的意義、肝病基因診斷思路及將來面臨的挑戰(zhàn)。

一、肝病基因診斷的意義

1.基因診斷可幫助理解肝病的發(fā)病機制

1993年及1996年分別克隆出了肝豆狀核變性(Wilson病)和遺傳性血色病致病基因，并明確兩者為單基因肝病。ATP7B基因功能研究發(fā)現其金屬結合區(qū)域與原核細胞重金屬轉運體類似，從而進一步研究得知銅轉運在Wilson病發(fā)病機制中的重要作用。同樣，血色病相關基因(HFE、SLC40A1、TFR2、HAMP及HJV)的發(fā)現及功能研究不僅為了解肝臟鐵代謝及調控奠定了扎實的基礎，亦明確了相關基因突變導致血色病的病理生理機制。肝病第一次全基因組關聯研究(GWAS)是針對膽結石進行的，ABCG5及ABCG8基因是重要易感基因，后續(xù)關于自身免疫性肝病的GWAS研究發(fā)現數十個與原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)及自身免疫性肝炎(AIH)相關的基因位點。多數基因位點與其他自身免疫性或免疫介導的疾病相關位點重合，提示自身免疫性肝病可能僅僅是自身免疫性疾病的肝臟表現。高?；蛭稽c與主要組織相容性抗原(MHC)關系密切，提示PBC、PSC及AIH的病理生理機制與后天性或適應性免疫反應相關。然而，基因突變對自身免疫性肝病的貢獻不足10%，50%以上的易感性可能來自環(huán)境因素。近年來，全外顯子組測序(WES)技術成功應用于發(fā)現不明原因兒童肝衰竭等疑難肝病基因基礎。也有之前未曾懷疑線粒體肝病的肝衰竭患兒檢查WES后發(fā)現MPV17及SERAC1等基因突變。近期研究結果表明部分膽管受累及肝細胞脂肪變性的肝病與先天性糖基化障礙有關，提示糖基化異常可導致膽管發(fā)育異常及肝細胞能量代謝障礙[20]。

2.基因診斷可明確肝病亞型

50年前報道的Byler病表現為嚴重程度不一的肝病，可表現為嬰兒期發(fā)病的進行性家族性肝內膽汁淤積癥(PFIC)，在成人期前可以發(fā)展為肝纖維化或終末期肝病。在過去20年的基礎研究中相繼發(fā)現并克隆出了負責肝細胞頂端膜攝取、毛細膽管膜分泌膽汁酸及其他物質的轉運蛋白。目前已知的PFIC亞型有PFIC-1型(ATP8B1缺陷病)、PFIC-2型(ABCB11缺陷病)、PFIC-3型(ABCB4缺陷病)、PFIC-4型(TJP2缺陷病)、PFIC-5型(NR1H4缺陷病)及PFIC-6型(MYO5B缺陷病)。本課題組不僅在國內首次報道PFIC-1型[3]、PFIC-2型[4]及PFIC-3型[5]，在國際上首次發(fā)現的MYO5B[9]、USB53[10]及ZFYVE19[11]等為嬰兒膽汁淤積癥致病的基因。同樣以直接膽紅素升高為主的高膽紅素血癥可以通過基因診斷分為ABCC2基因突變導致的Dubin-Johnson綜合征及SLCO1B1/SLCO1B3雙基因突變引起的Rotor綜合征。以間接膽紅素升高為主的高膽紅素血癥通過臨床表型及UGT1A1基因突變類型可分為Gilbert綜合征、Crigler-Najjar綜合征2型及Crigler-Najjar綜合征1型[21]。Alagille綜合征可分為JAG1基因突變引起的1型及NOTCH2基因突變引起的2型。

3.基因診斷可幫助肝病分類

脂肪肝通常是因飲酒或肥胖引起，化療及其他藥物也可引起脂肪肝。僅10%～20%的飲酒或肥胖人群會出現嚴重脂肪肝、嚴重肝纖維化或肝硬化。GWAS發(fā)現PNPLA3基因p.I148M變異與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)風險相關，也會增加酒精性脂肪肝病的嚴重程度。p.I148M變異在歐洲人群中頻率較高(21%～28%)，該位點的變異會增加3倍的NASH患病風險，增加12倍的肝癌患病風險?？茖W家們建議攜帶PNPLA3基因變異的NASH患者進一步分類為PNPLA3相關脂肪肝炎(PASH)，加強生活方式及飲食方面的干預，提前預防病情加重。目前已知近200個基因與纖毛功能異常有關，常表現為先天性肝纖維化(肝功能正常的門脈高壓癥)、膽管擴張、肝囊腫或慢性膽汁淤積性肝硬化，可合并腎囊腫、慢性腎功能不全、慢性肺病、不孕癥、腦積水、聽力異常及視網膜病變。這類疾病由膽管板發(fā)育不良導致，統稱為纖毛病(又稱肝腎纖維囊性病變或膽管板發(fā)育不良)，治療原則為利膽治療[22]。

4.基因診斷可幫助肝病治療

GWAS研究發(fā)現編碼干擾素λ3的IL28B基因變異與慢性丙型病毒性肝炎患者干擾素治療應答相關。IL28B及IL29基因變異不僅與丙型肝炎病毒(HCV)感染自愈相關，也決定了病毒性肝炎的嚴重程度。與NASH危險因素相關的PNPLA3及TM6SF2等基因也與影響心血管疾病風險相關。關于阿莫西林克拉維酸鉀相關的特發(fā)性藥物性肝損傷(DILI)的GWAS研究發(fā)現人類白細胞抗原(HLA)相關區(qū)域與DILI發(fā)病有關，提示人體對藥物本身、藥物代謝產物或藥物誘導的抗原會產生免疫反應，早期糖皮質激素治療可能有效阻斷肝病進展?；虼_診后的肝病患者接受針對病因的治療可延緩病情進展或逆轉肝臟病變，大大改善了患者預后及生存質量，如膽汁淤積癥利膽及補充脂溶性維生素治療、膽汁酸合成缺陷補充初級膽汁酸、肝豆狀核變性排銅、遺傳性血色病排鐵或放血、肝糖原累積病飲食治療等。隨著生物技術的發(fā)展，針對特定基因或特定突變類型的治療措施可能會逐漸成為現實，如影響蛋白折疊的錯義突變可通過分子伴侶治療改善蛋白功能[23]、終止碼突變使用小分子“readthrough”治療可能會達到基因繼續(xù)翻譯的目的[24]。

二、肝病的基因診斷思路

1.肝病的臨床表現可作為基因診斷的重要線索

肝病的臨床表現多樣，包括轉氨酶升高、高膽紅素血癥、膽汁淤積癥、肝功能衰竭、肝腫大、肝硬化、肝纖維化、門脈高壓、低蛋白血癥、腹腔積液、凝血功能異常、瘙癢及肝臟腫瘤等，也可有肝外器官系統受累。以膽汁淤積癥為主要表現的患者根據谷氨酰轉肽酶(GGT)水平高低分別篩查低GGT膽汁淤積癥相關PFIC-1、2、4、5、6型等相關基因及高GGT相關PFIC-3型基因。以轉氨酶升高、肝腫大及低血糖為主要表現的肝病患者應首選排查糖原累積病相關基因。嬰幼兒期急性或反復發(fā)熱相關肝功能衰竭患者應排查NBAS、RINT1及SCYL1等基因。以肝脾腫大、神經系統及肺部疾病為主要表現的患者應排查溶酶體病相關基因[25]。

2.肝病基因診斷對象的選擇

所有不明原因肝病及肝膽受累的多系統疾病患者，除外感染、免疫、藥物及解剖異常等因素后應排查遺傳性肝病可能。臨床已確診非遺傳性肝病但治療效果不如預期或出現不明原因的并發(fā)癥者也應考慮盡早進行基因診斷，排查潛在或合并存在的基因異常[1]。

3.肝病基因診斷方法的選擇

(1)單基因Sanger測序：適用于明確懷疑單基因突變的肝病患者，如肝豆狀核變性、Alagille綜合征、Citrin缺陷病及高膽紅素血癥等，也適用于高通量測序發(fā)現的基因突變位點的驗證；(2)多基因芯片(Panel)測序：適用于懷疑牽涉多個基因的某個代謝通路功能障礙引起的肝病患者，如糖原累積病、血色病、膽汁淤積癥及膽汁酸合成障礙等；(3)WES：適用于明確懷疑遺傳性肝病、但未能通過單基因或多基因芯片等測序方法找到致病基因的患者；(4)全基因組測序(WGS)：適用于WES檢查未能確診、懷疑內含子區(qū)突變或結構性變異導致肝病的患者；(5)線粒體基因測序：適用于懷疑線粒體肝病但WES或Panel測序未能找到影響線粒體功能的核基因突變患者；(6)單基因或全基因組拷貝數變異：適用于懷疑特定基因或染色體片段拷貝數變異導致的肝病患者；(7)快速WES或WGS檢查：可在數天內篩查遺傳性疾病，能夠幫助指導急危重患者得到及時有效的診治。隨著二代基因測序成本下降，既往單基因Sanger測序已被肝病相關多基因靶向測序所替代。相信在不久的將來，WES及WGS可能成為遺傳性肝病常規(guī)篩查手段。

4.正確解讀基因報告

應由熟悉患者臨床表現、發(fā)生突變的基因及基因突變性質的遺傳性肝病?？漆t(yī)生解讀基因報告。判斷基因變異的致病性應遵循美國遺傳學及基因組學學院(ACMG)相關指南[26]，務必結合患者臨床表型綜合判斷?；驒z查發(fā)現意義不明變異(VUS)的致病性判斷，需要依靠代謝組學測定明確對應的代謝異常、酶活性測定判斷蛋白功能改變或檢測特異性生化標志物。如膽汁酸合成障礙需要檢查膽汁酸譜，氨基酸、脂肪酸及有機酸代謝障礙需檢查血串聯質譜及測定尿有機酸譜、溶酶體病、NGLY1缺陷病酶活性、糖基化障礙糖組學等。確診或排除遺傳性肝病需要在臨床表型、基因型、生化標志物及功能研究方面有充分的依據。

三、肝病基因診斷面臨的挑戰(zhàn)及機遇

基因診斷數據量龐大，篩查并判斷眾多可疑致病突變與臨床表型的相關性需要較長時間及大量的功能驗證工作。近期發(fā)現的眾多疾病相關基因仍缺乏針對性治療措施，明確分子機制后仍需要建立細胞模型及動物模型以尋找有效藥物或其他干預措施。最終有效治療措施經過人體試驗驗證并普及到所有受累患者需要大量的時間、人工及經濟成本。

雖然基因診斷已成功應用于單基因或雙基因肝病的診治，部分復雜或疑難肝病仍無法明確其分子機制，考慮可能為環(huán)境因素與多基因代謝通路相互作用所致。WGS的優(yōu)點在于覆蓋了整個基因組序列，標本處理更加簡便、測序數據準確性更高、基因確診率更高。但WGS發(fā)現的變異更多，數據分析難度更大，有時無法辨別獨立致病的變異、參與致病的變異及決定療效的變異。雖然不是所有發(fā)現的變異均有臨床應用價值，但隨著臨床表型及基因型數據庫的不斷完善，肝病個體化醫(yī)療很可能在不久的將來成為現實。