顧錦 綜述，史偉峰 審校

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

蛋白質(zhì)的泛素化是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的共價(jià)修飾，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡等多種生物學(xué)功能。泛素分子是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的小分子多肽，由76個(gè)氨基酸殘基組成，泛素化修飾可將靶蛋白按蛋白酶體途徑或溶酶體途徑降解[1]。與其他的翻譯后修飾類(lèi)似，泛素化修飾是一個(gè)可逆的過(guò)程，泛素鏈可被去泛素化酶剪切，泛素特異性蛋白酶24(ubiquitin-specific protease 24，USP24)通過(guò)將泛素鏈與底物蛋白質(zhì)之間的連接以及泛素化鏈之間的連接裂解并切斷，使泛素化蛋白質(zhì)底物或蛋白酶體降解底物上的單泛素分子脫離出來(lái)，從而防止多聚泛素在底物蛋白質(zhì)聚集，單泛素分子可以重新進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的循環(huán)中，維持游離泛素和泛素結(jié)合蛋白的動(dòng)態(tài)平衡。USP24被報(bào)道在骨骼肌表達(dá)最高，其次是在卵巢，而在心臟、腦、肺、肝和腎臟呈中度表達(dá)，在胰腺、脾臟和睪丸呈低度表達(dá)[2]。目前，USP24被報(bào)道的研究主要有代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展、感染免疫、細(xì)胞周期調(diào)控等方面，其更多機(jī)制和生物學(xué)功能有待進(jìn)一步深入研究。

1 USP24的結(jié)構(gòu)和功能

最初USP24基因是在2005年由Oliveira等[3]發(fā)現(xiàn),他們?yōu)榱舜_定1p號(hào)染色體連鎖區(qū)域(LOD=3.41)上控制帕金森病(Parkinson′s disease, PD)發(fā)病年齡(AAO)的基因，使用了267個(gè)PD多發(fā)家族的整體數(shù)據(jù)集，采用迭代關(guān)聯(lián)映射法，從而確定了該區(qū)域的6個(gè)相關(guān)基因，但進(jìn)一步篩選與1號(hào)染色體位點(diǎn)相關(guān)的83個(gè)家族的子集，則僅發(fā)現(xiàn)了PD中與AAO顯著相關(guān)的2個(gè)基因，其中一個(gè)就是USP24基因。USP24定位于人1p32.3，含有2 620個(gè)氨基酸，68個(gè)外顯子，屬于半胱氨酸蛋白酶家族。USP24由泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(UBA)、泛素結(jié)構(gòu)域(UBL)和泛素特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域(USP)三部分組成，其中1 697位半胱氨酸是蛋白酶結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵位點(diǎn)[4]。另外在DNA損傷后USP24 1 620位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔琒1620A突變降低了USP24對(duì)P53的穩(wěn)定作用，這表明S1620可能是USP24共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)磷酸化位點(diǎn)。目前研究表明，USP24的靶蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子以及一些酶,近年來(lái)研究報(bào)道了一些USP24作用的底物，USP24可以與腫瘤抑制因子p300和凋亡誘導(dǎo)因子Bax結(jié)合抑制腫瘤的發(fā)生，與細(xì)胞真核轉(zhuǎn)錄因子E2F-4相互作用影響細(xì)胞G1-S過(guò)渡期進(jìn)程[5]；USP24還可以與腫瘤抑制因子p53、損傷特異性DNA結(jié)合蛋白2(damage specific DNA binding protein 2，DDB2)結(jié)合參與DNA損傷修復(fù)應(yīng)答[6]；USP24去泛素化抗凋亡蛋白MCL-1穩(wěn)定其活性促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，抑制USP24的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]；最新研究報(bào)道USP24通過(guò)影響ULK1蛋白的泛素化和穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)PD患者多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的自噬[8]。更多與USP24相作用的底物仍有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

1.1USP24與腫瘤細(xì)胞 Wang等[9]發(fā)現(xiàn)USP24在晚期肺癌臨床樣品中高表達(dá)，他們使用肺癌患者基因組DNA研究USP24的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，發(fā)現(xiàn)SNP 7656C/T升高；當(dāng)使用RNA標(biāo)本代替肺癌患者的基因組DNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)930C/T和7656T/C突變體的比例顯著增加，表明這兩個(gè)位點(diǎn)的突變體不僅由DNA的SNP引起，而且由RNA編輯引起；USP24變異體分析顯示，肺癌患者血液樣本中變異體比例明顯高于正常個(gè)體，因此認(rèn)為USP24-930T和USP24-7656C可以作為肺癌檢測(cè)的診斷標(biāo)記；還發(fā)現(xiàn)鼠雙微粒2(murine double minute 2, MDM2)是USP24作用的底物，過(guò)表達(dá)USP24可以上調(diào)MDM2導(dǎo)致Suv39h1甲基化酶水平降低，從而減少了H3K9的甲基化，并啟動(dòng)了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因ADAM9(ADAM metallopeptidase domain 9)、ADAM10(ADAM metallopeptidase domain 10)和CCL5(C-C motif chemokine ligand 5)的表達(dá)，最終導(dǎo)致肺癌的轉(zhuǎn)移。

Wang的團(tuán)隊(duì)揭示了USP24在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用后，繼續(xù)研究了USP24在癌癥形成過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)USP24正性調(diào)控了腫瘤的轉(zhuǎn)移，卻負(fù)性調(diào)控了腫瘤的發(fā)生。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)Bax和p300是USP24的底物。p300是一種腫瘤抑制因子，而B(niǎo)ax是一種可以防止癌癥形成的凋亡誘導(dǎo)因子，Ku70乙?；饔脮?huì)增加Bax的線(xiàn)粒體定位，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在癌癥早期和細(xì)胞周期的有絲分裂階段，USP24因磷酸化導(dǎo)致其水平降低，其底物蛋白p300、Bax表達(dá)減少?gòu)亩种萍?xì)胞凋亡形成癌癥。然而，過(guò)表達(dá)的USP24則增加了Bax水平和Ku70乙酰化介導(dǎo)的Bax線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)增加細(xì)胞凋亡，抑制了腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期進(jìn)程中G1-S過(guò)渡是癌癥形成的關(guān)鍵階段，真核轉(zhuǎn)錄因子E2F包含3個(gè)激活劑成員E2F1、E2F2和E2F3，2個(gè)抑制劑E2F3b和E2F4。E2F4通過(guò)抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄活性而參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)。USP24基因下調(diào)可降低E2F4，p130和TFDP1導(dǎo)致E2F1水平增加，隨后G1-S過(guò)渡增加，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

近年來(lái)，Wang等[10]又發(fā)現(xiàn)USP24在M2巨噬細(xì)胞和人晚期肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中表達(dá)上調(diào),USP24通過(guò)p300和β-TrCP穩(wěn)定以增加組蛋白H3乙?；蚇F-κB啟動(dòng)子的水平，從而增加M2巨噬細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)微環(huán)境中的IL-6并促進(jìn)腫瘤惡化。Transwell實(shí)驗(yàn)證明了使用USP24敲減的M2巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基降低了肺癌細(xì)胞的遷移和趨化活性。另外，將微血管內(nèi)皮細(xì)胞株1(HEMC-1)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)與USP24敲除的M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其微血管的形成能力被顯著抑制。繼而發(fā)現(xiàn)USP24基因敲除后的M2巨噬細(xì)胞和A549細(xì)胞分泌IL-6水平下降；將2 ng/mL的IL-6加入U(xiǎn)SP24敲除的M2巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，結(jié)果顯示A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。同時(shí)證實(shí)USP24通過(guò)穩(wěn)定肺癌細(xì)胞中β-Trcp分子以及肺癌細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞中p300分子，促進(jìn)IL-6的上調(diào)表達(dá)。將USP24基因敲除的CL1-5人肺腺癌細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到SCID小鼠體內(nèi)，觀(guān)察到USP24基因敲除的癌細(xì)胞中肺結(jié)節(jié)數(shù)量減少。結(jié)果表明，USP24上調(diào)與肺癌的惡性程度及腫瘤血管生成活性密切相關(guān)。因此研究證明通過(guò)調(diào)控USP24可為治療腫瘤提供新的途徑。

髓樣細(xì)胞白血病分子-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)屬于Bcl-2家屬成員之一，對(duì)T、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等生存非常重要[7]；MCL-1水平在淋巴瘤、慢性髓細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤中異常升高[11]。Schwickart等[12]發(fā)現(xiàn)，卵泡淋巴瘤和彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤MCL-1蛋白的增加與 USP9X表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，后者通過(guò)K48去泛素化穩(wěn)定抗凋亡蛋白MCL-1，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Peterson等[13]發(fā)現(xiàn)USP24與USP9X密切相關(guān)，USP9X敲除的細(xì)胞中USP24代償性上調(diào)，從而維持骨髓瘤細(xì)胞的存活和MCL-1的調(diào)節(jié)作用；當(dāng)USP24敲除時(shí)可導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞死亡；新型化合物EOAI3402143劑量依賴(lài)性地抑制USP9X和USP24活性，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且比直接抑制MCL-1更有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并完全阻斷或消退小鼠的骨髓瘤腫瘤。此研究提示抑制去泛素化酶的活性有望成為治療骨髓瘤和其他B細(xì)胞腫瘤新的策略。

1.2USP24與神經(jīng)退行性疾病 PD是由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性和選擇性丟失所致的第二種常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。盡管PD的發(fā)病機(jī)制還不清楚，但近來(lái)研究表明泛素-蛋白酶體通路的缺陷是導(dǎo)致PD的病因之一。Oliveira等[3]研究發(fā)現(xiàn)，USP24基因位于PD的Parkin基因10易感位點(diǎn)區(qū)域，與PD的發(fā)病密切相關(guān)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)USP24和USP40基因中的許多SNP與遲發(fā)性PD的發(fā)生有關(guān)，USP24和USP40的基因變異可導(dǎo)致白種人遲發(fā)性PD的風(fēng)險(xiǎn)增加。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)在60歲以上的中國(guó)臺(tái)灣人群中，USP24的rs487230位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在PD患者和對(duì)照組之間有明顯的差異，等位基因T和CT/TT基因型能夠減少PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，然而，這一結(jié)論在中國(guó)大陸尤其是漢族人群中尚未得到證實(shí)。Zhao等[16]挑選我國(guó)西南地區(qū)378例漢族PD患者與同地區(qū)274健康人對(duì)照，采用單堿基延伸技術(shù)分析多個(gè)SNPs，包括USP24的rs13312、rs1165226、rs487230和rs287235，以及USP40的rs1048603，結(jié)果表明PD組與對(duì)照組、早發(fā)性PD組與對(duì)照組、遲發(fā)性PD組與對(duì)照組、早發(fā)性PD組與遲發(fā)性PD組的基因型頻率、小等位基因頻率均無(wú)顯著差異；該研究首次報(bào)道中國(guó)漢族患者中USP24和USP40的SNPs與PD之間缺乏相關(guān)性。另外，USP24的rs287235小等位基因‘G’降低了挪威人發(fā)生PD的風(fēng)險(xiǎn)，但在美國(guó)人、愛(ài)爾蘭人以及其他白種人中未得以證實(shí)[17]。Wang等[18]從基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控著手，對(duì)人類(lèi)USP24基因啟動(dòng)子功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有一個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。為檢測(cè)USP24基因啟動(dòng)子活性是否受NF-κB調(diào)控，進(jìn)一步將 USP24p-C質(zhì)粒與NF-κB表達(dá)載體及相應(yīng)的空載體pMTF共轉(zhuǎn)染到HEK293和N2a細(xì)胞中，熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，NF-κB表達(dá)顯著增加了HEK293和N2a中USP24啟動(dòng)子活性。當(dāng)NF-κB信號(hào)被其特異性激活劑TNF-α激活或NF-κB水平升高時(shí)，USP24基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)；當(dāng)NF-κB在啟動(dòng)子上的順式作用元件被刪除或突變時(shí)，USP24基因啟動(dòng)子活性降低。因此，上述研究表明人類(lèi)USP24基因啟動(dòng)子受NF-κB的調(diào)控，NF-κB在細(xì)胞凋亡和炎癥中起著重要作用，而凋亡和炎癥均為神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的重要特征。最近Thayer等[8]指出自噬缺陷與PD多巴胺能神經(jīng)元變性之間存在因果關(guān)系，確定USP24是位于帕金森病10 (Parkinson disease 10)易感性基因位點(diǎn)與晚發(fā)性PD相關(guān)的基因。研究表明，USP24通過(guò)影響ULK1蛋白的泛素化和穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)自噬，USP24在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)分化為多巴胺能神經(jīng)元中的下調(diào)導(dǎo)致ULK1蛋白水平升高和自噬的增加,USP24敲除改善了衰老的iPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)突擴(kuò)展和/或維持,然而USP24對(duì)PD患者iPSC衍生神經(jīng)元的影響還有待進(jìn)一步的研究。

1.3USP24與DNA的損傷修復(fù) 細(xì)胞內(nèi)DNA損傷可受多種因素影響。在體內(nèi)主要有活性氧、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、拓?fù)洚悩?gòu)酶缺失導(dǎo)致的錯(cuò)配等因素；而在體外主要與電離輻射(IR)、紫外線(xiàn)(UV)及環(huán)境致癌物等有關(guān)。DNA損傷修復(fù)應(yīng)答過(guò)程包括誘導(dǎo)損傷部位的重新定位、信號(hào)傳導(dǎo)、修復(fù)因子進(jìn)入DNA損傷部位并進(jìn)行修復(fù)等過(guò)程[19]。目前，研究發(fā)現(xiàn)去泛素化已經(jīng)成為調(diào)控DNA修復(fù)途徑的重要機(jī)制之一。其中DDB2參與DNA損傷識(shí)別的核苷酸切除修復(fù)途徑(nucleotide excision repair，NER)，為染色質(zhì)DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks，DSBs)有效修復(fù)關(guān)鍵分子。DDB2是CRL4-DDB2-E3連接酶的一個(gè)成分，該連接酶以著色性干皮病基因組C(xeroderma pigmentosum group C，XPC)、組蛋白和DDB2本身為靶標(biāo)[6]。DDB2被認(rèn)為是針對(duì)DNA損傷位點(diǎn)的E3連接酶復(fù)合物的底物受體。Zhang等[4]采用酵母雙雜交篩選人cDNA文庫(kù)來(lái)鑒定潛在的DDB2底物，經(jīng)免疫共沉淀法證實(shí)USP24為DDB2相互作用蛋白。將HeLa和293T兩種細(xì)胞中USP24基因敲除后，其DDB2的穩(wěn)態(tài)水平下降，說(shuō)明USP24是一種新的DDB2穩(wěn)定調(diào)節(jié)分子，其去泛素化作用可阻止DDB2的降解，從而維持了DDB2的穩(wěn)定性。

抑癌基因p53在50%以上惡性腫瘤中可發(fā)生突變。P53也是一種半衰期很短的蛋白質(zhì)且受到泛素化和去泛素化的嚴(yán)格調(diào)控[20]。p53被MDM2和其他幾種E3連接酶泛素化，并被許多去泛素化酶(DUB)去泛素化，包括USP7、USP10、USP11、USP29、USP42、OTUD1和OTUD5[4]。那么這么多DUB如何進(jìn)行協(xié)調(diào)以維持p53穩(wěn)定性和活性，原因可能有多種。首先，不同的DUB可能會(huì)響應(yīng)不同的細(xì)胞應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)p53,USP24是一種新發(fā)現(xiàn)的P53去泛素化酶，在紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的DNA損傷時(shí)起到穩(wěn)定P53的作用。HCT116細(xì)胞經(jīng)紫外線(xiàn)照射(254 nm，20 J/m2)后，其P53趨于穩(wěn)定且水平迅速升高，當(dāng)USP24蛋白耗盡時(shí)，P53水平則顯著下降，P53的穩(wěn)定程度與細(xì)胞內(nèi)USP24蛋白的殘留呈正相關(guān)。USP24基因缺失時(shí)，HCT116細(xì)胞中P53的穩(wěn)定性被破壞，而USP24表達(dá)重建可恢復(fù)P53的穩(wěn)定，表明USP24在紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的P53穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，是紫外線(xiàn)損傷應(yīng)答的一種調(diào)節(jié)因子[21]。

1.4USP24與病原體感染 巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種緩慢復(fù)制的皰疹病毒，在成纖維細(xì)胞中需48～72 h達(dá)到增殖高峰。因此為了有足夠的時(shí)間來(lái)完成其復(fù)制周期，HCMV編碼如pUL36、pUL37x1和pUL38等蛋白質(zhì)來(lái)阻止未成熟細(xì)胞死亡。USP24基因敲除可抑制pUL38缺陷型HCMV感染過(guò)程中的細(xì)胞死亡，提示pUL38通過(guò)和USP24相互拮抗實(shí)現(xiàn)其功能。而且，pUL38通過(guò)阻斷USP24介導(dǎo)的鐵蛋白在溶酶體中的降解來(lái)維持溶酶體的完整性和細(xì)胞活力。敲除USP24基因則可降低溶酶體中核受體輔激活物4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA 4)的穩(wěn)定性和鐵蛋白重鏈的降解[22]。研究闡明USP24通過(guò)調(diào)節(jié)鐵代謝來(lái)提高宿主的抗病毒作用，那么USP24能否在固有免疫通路中結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒反應(yīng)目前尚未有研究報(bào)道，USP24與其他去泛素化酶對(duì)固有免疫的調(diào)節(jié)是否有異同點(diǎn)仍然值得深入研究。

1.5USP24與精子發(fā)育 Hu等[23]發(fā)現(xiàn)小鼠性器官USP24主要定位于睪丸的支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，受雄激素受體(androgen receptor，AR)調(diào)控，而AR主要在小鼠睪丸的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和管周樣肌細(xì)胞中表達(dá)；USP24被確認(rèn)為是AR下游的一個(gè)靶基因，其表達(dá)水平的升高與小鼠的性發(fā)育有關(guān)，USP24可能參與了調(diào)控小鼠的精子發(fā)生過(guò)程。目前對(duì)于USP24參與調(diào)控人類(lèi)精子細(xì)胞的研究尚未報(bào)道，仍待進(jìn)一步研究。

2 小結(jié)

去泛素化酶通過(guò)剪切底物蛋白K48、K63等連接的多聚泛素化鏈，影響靶位蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)控蛋白質(zhì)的代謝，因而去泛素化酶活性的異常改變是誘發(fā)腫瘤、感染、自身免疫性疾病等主要原因之一。目前研究表明USP24與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、DNA損傷修復(fù)、病毒感染等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但目前其作用及機(jī)制研究仍不夠深入。因此，進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)組學(xué)、比較基因組學(xué)和表觀(guān)遺傳學(xué)等方法尋找USP24相互作用的靶蛋白及其相關(guān)的調(diào)控因子，或可為治療上述疾病提供理論依據(jù)和新的策略。