楊鴻林，蔣廷旺，龔燕萍，沈昊，錢靖，鈕麗萍，朱安渡，錢雄杰

(1. 蘇州市第九人民醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215200；2. 常熟市第二人民醫(yī)院科技處，江蘇常熟 215500；3. 常熟市醫(yī)學(xué)檢驗所，江蘇常熟 215500)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種好發(fā)于女性，以肝內(nèi)小膽管炎性損傷為早期病理改變的自身免疫性肝病。盡管研究發(fā)現(xiàn)T細胞、天然殺傷細胞(NK細胞)在PBC炎性損傷過程中發(fā)揮重要作用，但是其確切的發(fā)病機制仍不明確。B細胞在產(chǎn)生自身抗體、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)釋放及維持機體對自身抗原免疫耐受平衡方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。通常情況下，B細胞輔助T細胞的活化和增殖，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)B細胞通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β或細胞間直接相互作用發(fā)揮負向免疫調(diào)控作用，稱之為調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells, Breg)[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Breg通過產(chǎn)生IL-10在慢性乙型肝炎中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致了機體抗病毒能力下降[2]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷代謝通路相關(guān)分子CD39和CD73在B細胞表面的表達情況與免疫抑制作用存在緊密相關(guān)性[3]。但是PBC患者中B細胞表面CD39和CD73分子的表達情況如何，其變化對PBC有著怎樣的意義目前尚無相關(guān)研究，本研究就此作初步探討。

1 材料和方法

1.1研究對象 連續(xù)、隨機選擇2017年1月至2018年12月期間蘇州市第九人民醫(yī)院和常熟市第二人民醫(yī)院初次就診的PBC患者60例，男16例，女44例，年齡[中位數(shù)(四分位數(shù))]為58.5(52.3, 70.8)歲；體檢健康者(health controls, HCs)40例，男11例，女29例，年齡56.0(50.0, 69.0)歲。符合以下3個條件中的任意2個診斷為PBC[4]：血清抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)滴度≥40；不明原因的血清堿性磷酸酶(ALP)超過正常水平1.5倍，且持續(xù)24周以上；肝內(nèi)匯管區(qū)小膽管損傷。所有病例排除肝癌、病毒性肝炎及其他自身免疫病。

1.2主要試劑和儀器 anti-CD39-PE(555464)、anti-CD73-PerCP-cy5.5(561260)、anti-CD19-FITC(555412)(美國BD公司)，F(xiàn)icoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液(美國GE公司)，多重微珠流式熒光抗核抗體譜檢測試劑盒(美國宙斯公司)，免疫印跡自身抗體試劑盒(德國歐蒙公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)試劑盒及復(fù)合校準品(日本世諾公司)，ALP試劑盒(中國九強公司)，總膽紅素(T-Bil)及復(fù)合校準品(中國伊譜諾康公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全自動生化免疫分析儀(德國西門子公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3標本采集和流式細胞術(shù) 采集患者清晨空腹血分別于肝素鋰抗凝管和無抗凝劑促凝管，抗凝血用于流式細胞術(shù)分析，促凝血3 000 r/min離心10 min后進行肝功能相關(guān)指標分析。分離抗凝血外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，然后將分離的細胞重懸于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，調(diào)整細胞濃度至1×106/mL。在每個流式上樣管中加入100 μL 全血樣本，加入anti-CD19-FITC、anti-CD73-PerCP-cy5.5和anti-CD39-PE抗體各10 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入2 mL溶血素，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入2 mL(pH7.2)PBS，混勻，1 500 r/min 5 min棄上清液；加入約500 μL PBS，混勻，待測。流式細胞儀檢測后以FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4自身抗體檢測 用多重微珠流式熒光法定量分析抗線粒體抗體M2(anti-mitochondrial antibody M2, ANA-M2)IgG抗體，按試劑盒說明書進行。取出試劑盒平衡至室溫并將微珠和配套試劑混勻；陰性對照、陽性對照和患者標本按照1∶21稀釋；每孔加入50 μL復(fù)合微珠懸浮液后加入10 μL稀釋后的樣本和對照品；室溫放置30 min后，用真空抽濾泵移除孔內(nèi)溶液后洗滌3次；輕輕吸干過濾板底部并在空氣中晾干3～5 min；每孔中加入150 μL結(jié)合劑，室溫再次放置30 min后，讀取和分析數(shù)據(jù)，結(jié)果判讀標準：<120為陰性；≥120為陽性。用免疫印跡法檢測抗糖蛋白210抗體(anti-GP210)、抗核蛋白體100抗體(anti-SP100)，參考試劑盒說明書進行。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 19.0軟件進行。定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間差異以Mann-WhitneyU秩和檢驗進行統(tǒng)計分析；定性數(shù)據(jù)以率表示，用卡方檢驗進行統(tǒng)計分析；以Spearman相關(guān)分析指標間相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者基本資料 PBC患者及對照組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PBC組肝功能相關(guān)指標ALT、AST、ALP、GGT和T-Bil較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PBC組AMA-M2均為陽性，anti-GP210陽性14例(23.3%)，anti-SP100陽性12例(20.0%)。見表1。

表1 PBC患者和健康人對照者實驗室檢查結(jié)果

2.2CD39+CD73+B細胞在PBC患者中的變化情況 PBC組CD39+CD73+B細胞在B細胞中所占比例為55.6%(44.9%，60.5%)，健康人對照組為73.0%(69.8%，74.9%)，PBC組較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=7.691,P<0.001)。見圖1。

注：A、B為PBC患者，C、D為健康人對照者。

2.3PBC組CD39+CD73+B細胞與自身抗體的關(guān)系 將PBC組CD39+CD73+B細胞和AMA-M2定量檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯的負相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.349，P=0.027)，見圖2；anti-GP210陽性組CD39+CD73+B細胞比例為44.6%(38.2%，49.9%)，明顯低于anti-GP210陰性患者58.7%(49.8%，63.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.099，P<0.001)；anti-SP100陽性組為58.6%(47.9%，62.7%)，陰性組為51.6%(44.7%，60.4%)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.054，P=0.292)。

圖2PBC組CD39+CD73+B細胞與AMA-M2定量結(jié)果之間相關(guān)性分析

3 討論

近年來B細胞在腫瘤、自身免疫病中的作用再次成為研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤增殖、自身免疫炎性反應(yīng)免疫調(diào)控中的作用明顯被低估[5]。在一些自身免疫病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、SLE等)中B細胞的調(diào)節(jié)機制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)Breg可以通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β、IL-35、IgM和IgG4等多種免疫分子參與免疫應(yīng)答的調(diào)控[6]。既往研究認為Breg主要通過IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但是能夠產(chǎn)生IL-10的B細胞無論在活化或是非活化狀態(tài)下均較少，即使通過IL-4和CD40L進行體外活化仍然處于較低水平[7]。近期的研究發(fā)現(xiàn)CD39和CD73在B細胞表面呈現(xiàn)高表達，且腺苷代謝通路在腫瘤和自身免疫病中均有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，因此也有學(xué)者將CD19+CD39+CD73+B細胞定義為調(diào)節(jié)性B細胞，并發(fā)現(xiàn)通過抗腫瘤治療后產(chǎn)生腺苷(adenosine，ADO)的B細胞顯著降低，且CD39表達水平與ADO表達水平呈顯著相關(guān)，證明了Breg通過產(chǎn)生ADO抑制CD4+T細胞的活化增強了抗炎效果[8]。本研究首次對PBC患者外周血同時表達CD39和CD73的B細胞進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人對照比較，其CD39+CD73+B細胞比例顯著降低。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)PBC患者調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)表面CD39分子表達顯著降低，而CD73無明顯變化[9]，提示腺苷代謝通路紊亂在PBC的發(fā)病機制中具有一定作用。ATP具有促進炎癥反應(yīng)的作用，在CD39和CD73的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳DO，ADO可以抑制CD4+、CD8+T細胞和NK細胞的活化發(fā)揮免疫調(diào)控作用，通過降低炎性介質(zhì)的釋放抑制炎癥反應(yīng)。因此，一方面，PBC患者B細胞中CD39和CD73分子的低表達可能會導(dǎo)致ATP在體內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致炎性損傷加劇，促進PBC進展；另一方面，PBC患者B細胞的CD39和CD73低表達有可能直接導(dǎo)致患者肝組織內(nèi)ADO產(chǎn)生減少，促進了抗原特異性T細胞的活化，進而促進了PBC患者的炎性損傷和病程加劇。之前在Treg的研究中我們通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PBC患者血清ATP水平確實有所增加，這進一步印證了腺苷代謝通路在T、B細胞水平上均出現(xiàn)異常，促進了PBC的發(fā)生和發(fā)展。

PBC患者血清自身抗體主要包括AMAs和抗核抗體(anti-nuclear antibodies, ANAs)，其中90%以上患者血清AMAs陽性，而ANAs陽性率大約50%。AMAs中與PBC相關(guān)的主要是AMA-M2、AMA-M4、AMA-M8、AMA-M9，ANAs的主要特異性靶抗原包括anti-SP100蛋白、核小體主要組成部分和核膜部分。核孔復(fù)合體是核膜的組成部分，包括100多種蛋白質(zhì)，其中最重要的是糖蛋白210(GP210)[10-11]。除AMA-M2之外，anti-GP210和anti-SP100是PBC最重要的特異性自身抗體，本研究中PBC患者兩者陽性率分別為23.3%和20.0%。國外有研究報道PBC中anti-GP210 陽性率為25%，與本研究基本一致，但是anti-SP100 為44%，顯著高于本研究，有可能與人種人群不同有關(guān)[12-13]。anti-GP210陽性患者CD39+CD73+B細胞比例低于陰性患者，而且PBC患者CD39+CD73+B細胞與AMA-M2定量檢測結(jié)果呈負相關(guān)關(guān)系，一方面提示該B細胞亞群可能參與調(diào)解PBC自身抗體產(chǎn)生過程，另一方面，可能與PBC患者病情嚴重程度存在相關(guān)性。有研究表明，anti-GP210抗體陽性的PBC患者臨床預(yù)后明顯較差。而AMA-M2在病情嚴重程度方面存在爭議[14]。由此可見，CD39+CD73+B細胞比例的降低對于PBC的病情可能存在提示作用，CD39和CD73的低表達可能促進了肝內(nèi)腺苷代謝通路的紊亂，加劇了炎性損傷。但是PBC患者B細胞對ATP的分解代謝能力及其具體的作用機制需要進一步以體外試驗進行研究，本研究只能從理論上對此進行推導(dǎo)。