楊鴻林，蔣廷旺，龔燕萍，沈昊，錢靖，鈕麗萍，朱安渡，錢雄杰

(1. 蘇州市第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215200；2. 常熟市第二人民醫(yī)院科技處，江蘇常熟 215500；3. 常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇常熟 215500)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種好發(fā)于女性，以肝內(nèi)小膽管炎性損傷為早期病理改變的自身免疫性肝病。盡管研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)在PBC炎性損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是其確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確。B細(xì)胞在產(chǎn)生自身抗體、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)釋放及維持機(jī)體對(duì)自身抗原免疫耐受平衡方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。通常情況下，B細(xì)胞輔助T細(xì)胞的活化和增殖，但是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-10、TGF-β或細(xì)胞間直接相互作用發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用，稱之為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells, Breg)[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Breg通過(guò)產(chǎn)生IL-10在慢性乙型肝炎中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致了機(jī)體抗病毒能力下降[2]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷代謝通路相關(guān)分子CD39和CD73在B細(xì)胞表面的表達(dá)情況與免疫抑制作用存在緊密相關(guān)性[3]。但是PBC患者中B細(xì)胞表面CD39和CD73分子的表達(dá)情況如何，其變化對(duì)PBC有著怎樣的意義目前尚無(wú)相關(guān)研究，本研究就此作初步探討。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)、隨機(jī)選擇2017年1月至2018年12月期間蘇州市第九人民醫(yī)院和常熟市第二人民醫(yī)院初次就診的PBC患者60例，男16例，女44例，年齡[中位數(shù)(四分位數(shù))]為58.5(52.3, 70.8)歲；體檢健康者(health controls, HCs)40例，男11例，女29例，年齡56.0(50.0, 69.0)歲。符合以下3個(gè)條件中的任意2個(gè)診斷為PBC[4]：血清抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)滴度≥40；不明原因的血清堿性磷酸酶(ALP)超過(guò)正常水平1.5倍，且持續(xù)24周以上；肝內(nèi)匯管區(qū)小膽管損傷。所有病例排除肝癌、病毒性肝炎及其他自身免疫病。

1.2主要試劑和儀器 anti-CD39-PE(555464)、anti-CD73-PerCP-cy5.5(561260)、anti-CD19-FITC(555412)(美國(guó)BD公司)，F(xiàn)icoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)GE公司)，多重微珠流式熒光抗核抗體譜檢測(cè)試劑盒(美國(guó)宙斯公司)，免疫印跡自身抗體試劑盒(德國(guó)歐蒙公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)試劑盒及復(fù)合校準(zhǔn)品(日本世諾公司)，ALP試劑盒(中國(guó)九強(qiáng)公司)，總膽紅素(T-Bil)及復(fù)合校準(zhǔn)品(中國(guó)伊譜諾康公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全自動(dòng)生化免疫分析儀(德國(guó)西門子公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3標(biāo)本采集和流式細(xì)胞術(shù) 采集患者清晨空腹血分別于肝素鋰抗凝管和無(wú)抗凝劑促凝管，抗凝血用于流式細(xì)胞術(shù)分析，促凝血3 000 r/min離心10 min后進(jìn)行肝功能相關(guān)指標(biāo)分析。分離抗凝血外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，然后將分離的細(xì)胞重懸于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。在每個(gè)流式上樣管中加入100 μL 全血樣本，加入anti-CD19-FITC、anti-CD73-PerCP-cy5.5和anti-CD39-PE抗體各10 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入2 mL溶血素，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入2 mL(pH7.2)PBS，混勻，1 500 r/min 5 min棄上清液；加入約500 μL PBS，混勻，待測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)后以FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4自身抗體檢測(cè) 用多重微珠流式熒光法定量分析抗線粒體抗體M2(anti-mitochondrial antibody M2, ANA-M2)IgG抗體，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取出試劑盒平衡至室溫并將微珠和配套試劑混勻；陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和患者標(biāo)本按照1∶21稀釋；每孔加入50 μL復(fù)合微珠懸浮液后加入10 μL稀釋后的樣本和對(duì)照品；室溫放置30 min后，用真空抽濾泵移除孔內(nèi)溶液后洗滌3次；輕輕吸干過(guò)濾板底部并在空氣中晾干3～5 min；每孔中加入150 μL結(jié)合劑，室溫再次放置30 min后，讀取和分析數(shù)據(jù)，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：<120為陰性；≥120為陽(yáng)性。用免疫印跡法檢測(cè)抗糖蛋白210抗體(anti-GP210)、抗核蛋白體100抗體(anti-SP100)，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS 19.0軟件進(jìn)行。定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間差異以Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；定性數(shù)據(jù)以率表示，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；以Spearman相關(guān)分析指標(biāo)間相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者基本資料 PBC患者及對(duì)照組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PBC組肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST、ALP、GGT和T-Bil較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PBC組AMA-M2均為陽(yáng)性，anti-GP210陽(yáng)性14例(23.3%)，anti-SP100陽(yáng)性12例(20.0%)。見(jiàn)表1。

表1 PBC患者和健康人對(duì)照者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

2.2CD39+CD73+B細(xì)胞在PBC患者中的變化情況 PBC組CD39+CD73+B細(xì)胞在B細(xì)胞中所占比例為55.6%(44.9%，60.5%)，健康人對(duì)照組為73.0%(69.8%，74.9%)，PBC組較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=7.691,P<0.001)。見(jiàn)圖1。

注：A、B為PBC患者，C、D為健康人對(duì)照者。

2.3PBC組CD39+CD73+B細(xì)胞與自身抗體的關(guān)系 將PBC組CD39+CD73+B細(xì)胞和AMA-M2定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.349，P=0.027)，見(jiàn)圖2；anti-GP210陽(yáng)性組CD39+CD73+B細(xì)胞比例為44.6%(38.2%，49.9%)，明顯低于anti-GP210陰性患者58.7%(49.8%，63.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.099，P<0.001)；anti-SP100陽(yáng)性組為58.6%(47.9%，62.7%)，陰性組為51.6%(44.7%，60.4%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.054，P=0.292)。

圖2PBC組CD39+CD73+B細(xì)胞與AMA-M2定量結(jié)果之間相關(guān)性分析

3 討論

近年來(lái)B細(xì)胞在腫瘤、自身免疫病中的作用再次成為研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤增殖、自身免疫炎性反應(yīng)免疫調(diào)控中的作用明顯被低估[5]。在一些自身免疫病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、SLE等)中B細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)Breg可以通過(guò)產(chǎn)生IL-10、TGF-β、IL-35、IgM和IgG4等多種免疫分子參與免疫應(yīng)答的調(diào)控[6]。既往研究認(rèn)為Breg主要通過(guò)IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但是能夠產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞無(wú)論在活化或是非活化狀態(tài)下均較少，即使通過(guò)IL-4和CD40L進(jìn)行體外活化仍然處于較低水平[7]。近期的研究發(fā)現(xiàn)CD39和CD73在B細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表達(dá)，且腺苷代謝通路在腫瘤和自身免疫病中均有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，因此也有學(xué)者將CD19+CD39+CD73+B細(xì)胞定義為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)抗腫瘤治療后產(chǎn)生腺苷(adenosine，ADO)的B細(xì)胞顯著降低，且CD39表達(dá)水平與ADO表達(dá)水平呈顯著相關(guān)，證明了Breg通過(guò)產(chǎn)生ADO抑制CD4+T細(xì)胞的活化增強(qiáng)了抗炎效果[8]。本研究首次對(duì)PBC患者外周血同時(shí)表達(dá)CD39和CD73的B細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人對(duì)照比較，其CD39+CD73+B細(xì)胞比例顯著降低。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)PBC患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表面CD39分子表達(dá)顯著降低，而CD73無(wú)明顯變化[9]，提示腺苷代謝通路紊亂在PBC的發(fā)病機(jī)制中具有一定作用。ATP具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，在CD39和CD73的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳DO，ADO可以抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化發(fā)揮免疫調(diào)控作用，通過(guò)降低炎性介質(zhì)的釋放抑制炎癥反應(yīng)。因此，一方面，PBC患者B細(xì)胞中CD39和CD73分子的低表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致ATP在體內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致炎性損傷加劇，促進(jìn)PBC進(jìn)展；另一方面，PBC患者B細(xì)胞的CD39和CD73低表達(dá)有可能直接導(dǎo)致患者肝組織內(nèi)ADO產(chǎn)生減少，促進(jìn)了抗原特異性T細(xì)胞的活化，進(jìn)而促進(jìn)了PBC患者的炎性損傷和病程加劇。之前在Treg的研究中我們通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PBC患者血清ATP水平確實(shí)有所增加，這進(jìn)一步印證了腺苷代謝通路在T、B細(xì)胞水平上均出現(xiàn)異常，促進(jìn)了PBC的發(fā)生和發(fā)展。

PBC患者血清自身抗體主要包括AMAs和抗核抗體(anti-nuclear antibodies, ANAs)，其中90%以上患者血清AMAs陽(yáng)性，而ANAs陽(yáng)性率大約50%。AMAs中與PBC相關(guān)的主要是AMA-M2、AMA-M4、AMA-M8、AMA-M9，ANAs的主要特異性靶抗原包括anti-SP100蛋白、核小體主要組成部分和核膜部分。核孔復(fù)合體是核膜的組成部分，包括100多種蛋白質(zhì)，其中最重要的是糖蛋白210(GP210)[10-11]。除AMA-M2之外，anti-GP210和anti-SP100是PBC最重要的特異性自身抗體，本研究中PBC患者兩者陽(yáng)性率分別為23.3%和20.0%。國(guó)外有研究報(bào)道PBC中anti-GP210 陽(yáng)性率為25%，與本研究基本一致，但是anti-SP100 為44%，顯著高于本研究，有可能與人種人群不同有關(guān)[12-13]。anti-GP210陽(yáng)性患者CD39+CD73+B細(xì)胞比例低于陰性患者，而且PBC患者CD39+CD73+B細(xì)胞與AMA-M2定量檢測(cè)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，一方面提示該B細(xì)胞亞群可能參與調(diào)解PBC自身抗體產(chǎn)生過(guò)程，另一方面，可能與PBC患者病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。有研究表明，anti-GP210抗體陽(yáng)性的PBC患者臨床預(yù)后明顯較差。而AMA-M2在病情嚴(yán)重程度方面存在爭(zhēng)議[14]。由此可見(jiàn)，CD39+CD73+B細(xì)胞比例的降低對(duì)于PBC的病情可能存在提示作用，CD39和CD73的低表達(dá)可能促進(jìn)了肝內(nèi)腺苷代謝通路的紊亂，加劇了炎性損傷。但是PBC患者B細(xì)胞對(duì)ATP的分解代謝能力及其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步以體外試驗(yàn)進(jìn)行研究，本研究只能從理論上對(duì)此進(jìn)行推導(dǎo)。