陳 婕，鄧愛華，劉 聃，劉康珂，柏珊珊，段艷輝，黃 穎，王 志

（1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，湖南常德 415000；2.湖南文理學院芙蓉學院，湖南常德 415000；3.澧縣扶農中藥材農民專業(yè)合作社，湖南常德 415000）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis） 中梔子苷含量可達10.4 mg/g[1]，其廣泛用于改善睡眠[2]、清熱瀉火[3]、保肝利膽[4]等藥物的開發(fā)。試驗通過響應面法優(yōu)化正丁醇萃取法純化梔子苷的影響因素，并對各個因素的顯著性及交互作用進行分析，以期為梔子中梔子苷的工業(yè)化分離提供理論依據和生產指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梔子果，澧縣扶農中藥材農民專業(yè)合作社提供；梔子苷標準品，北京盛世康普化工技術研究院提供；甲醇（AR）、正丁醇（AR），湖南匯虹試劑有限公司提供。

PHS-25型pH計，上海精密科學儀器有限公司產品；TDL-40B型高速離心機，上海安寧科學儀器廠產品；RE52A型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產品；UV-1800型紫外分光光度計，長沙市天恒儀器有限公司產品；101-2AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產品；HJ-6型磁力加熱攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠產品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

稱取梔子干果適量，粉碎過40目篩，石油醚脫脂，按料液比1∶20加入50%甲醇水溶液，在超聲頻率40 kHz，超聲功率150 W下提取30 min，浸提3次，合并濾液過濾、真空濃縮得到梔子浸膏。取梔子浸膏溶于水配置不同濃度的梔子苷水溶液，再加入一定比例的正丁醇，萃取一定的時間后靜置分相，紫外分光光度計檢測梔子苷的萃取率。

1.3 試驗設計

1.3.1 梔子苷標準曲線制備

精密稱取15 mg梔子苷標準品，用甲醇定容至100 mL，配制0.15 mg/mL的標準品母液。分別吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL母液，加入甲醇定容至50 mL，得到 1.5，3.0，6.0，12.0，18.0，24.0 μg/mL梔子苷標準溶液。以甲醇為空白對照，在波長238 nm處測吸光度。以梔子苷標準品質量濃度為橫坐標（C）、吸光度為縱坐標（A），繪制標準曲線。得梔子苷的標準曲線方程為A=0.0173C+0.13，R2=0.999 9，R2接近于1，結果表明梔子苷質量濃度在 1.5～24.0 μg/mL線性關系良好。

1.3.2 單因素試驗

配制一定質量濃度的梔子苷水溶液，加入正丁醇萃取。分別考查萃取時間（10，20，30，40，50 min）、萃取溫度（15，25，35，45，55℃）、梔子苷質量濃度（2，4，6，8，10 mg/mL）、正丁醇/水溶液體積比 （0.50∶1，0.75∶1，1.00∶1，1.25∶1，1.50∶1）、pH 值 （3.0，5.0，7.0，9.0，11.0） 等對梔子苷萃取率的影響。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，選取萃取溫度、梔子苷質量濃度、正丁醇/水溶液體積比為考查因素，以梔子苷萃取率為響應值，運用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-behnken響應面試驗設計和數(shù)據分析。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 萃取時間對萃取率的影響

萃取時間對萃取率的影響見圖1。

圖1 萃取時間對萃取率的影響

由圖1可知，萃取率隨萃取時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。隨著萃取時間的增加，梔子苷逐漸富集到有機相中，梔子苷的萃取率不斷增大。由于正丁醇在上相易揮發(fā)，如萃取時間進一步延長，正丁醇體積減少，更多雜質進入正丁醇相，導致梔子苷萃取率下降，選擇萃取時間為30 min。

2.1.2 萃取溫度對萃取率的影響

萃取溫度對萃取率的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對萃取率的影響

由圖2可知，萃取率隨萃取溫度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。萃取溫度的增加會提高溶質的傳質效率，提高萃取率，同時也會加快正丁醇的揮發(fā)速度，降低正丁醇量，選擇萃取溫度為45℃。

2.1.3 梔子苷質量濃度對萃取率的影響

梔子苷質量濃度對萃取率的影響見圖3。

圖3 梔子苷質量濃度對萃取率的影響

由圖3可知，隨著梔子苷質量濃度增大，梔子苷萃取率增加。當正丁醇相中溶解的梔子苷達到飽和狀態(tài)時，繼續(xù)增加梔子苷質量濃度，反而導致萃取率下降，選擇梔子苷質量濃度為4 mg/mL。

2.1.4 相比對萃取率的影響

相比對萃取率的影響見圖4。

圖4 相比對萃取率的影響

由圖4可知，隨著正丁醇/梔子水溶液體積比的增加，萃取率先增加后降低。正丁醇質量濃度的增加，體系的極性發(fā)生改變，根據相似相溶原理，梔子苷萃取率在一定范圍內增加，選擇相比為0.5∶1。

2.1.5 pH值對萃取率的影響

pH值對萃取率的影響見圖5。

圖5 pH值對萃取率的影響

由圖5可知，隨著pH值的增大，萃取率緩慢下降，但整體影響不明顯。為了減少雜質離子的引入，選擇pH值為7.0。

2.2 Box-behnken試驗設計及結果

響應面試驗設計及結果見表2，回歸方程顯著性檢驗結果見表3。

表2 響應面試驗設計與結果

使用Design Expert 8.0.6對表2數(shù)據進行多元回歸擬合，得到回歸方程方差分析結果表3。對結果進行二次回歸擬合后，得相比（A）、萃取溫度（B）和梔子苷質量濃度（C）對梔子苷萃取率的二次多項回歸方程：

表3 回歸方程顯著性檢驗結果

方差分析顯示模型顯著（p＜0.05），失擬項不顯著（p＞0.05），因此模型成立。從表3可知，一次項C、交互相AC及二次項A2，B2，C2對萃取率的影響非常顯著（p＜0.001）；交互相AB、BC對萃取率的影響極顯著（p＜0.01）；一次項A，B對萃取率的影響顯著（p＜0.05）；由F值可知，在所選試驗范圍內，A（相比）、B（萃取溫度）和C（梔子苷質量濃度）對萃取率的影響順序為C（梔子苷質量濃度） ＞ A（相比） ＞B（萃取溫度）。

2.3 響應面試驗結果分析

交互作用對萃取率影響響應面圖見圖6。

對比曲面陡峭程度，發(fā)現(xiàn)與方差分析結果一致，梔子苷質量濃度與相比之間存在非常顯著的交互作用，相比與萃取溫度、萃取溫度與梔子苷質量濃度之間存在顯著的交互作用。

2.4 最優(yōu)萃取工藝條件的確定

利用Design Expert 8.0.6軟件由所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最佳萃取工藝條件為萃取時間30 min，萃取溫度45.93℃，梔子苷質量濃度2.68 mg/mL，相比0.398∶1，pH值7.0，預測梔子苷萃取率為30.18%。為了適合實際操作，調整條件萃取時間30 min，萃取溫度45℃，梔子苷質量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，通過3組平行試驗，梔子苷萃取率平均值為30.27%±0.08%，與預測值無顯著性差異（p＞0.05）。證明此條件為梔子苷萃取的最優(yōu)條件，該回歸方程可用于實踐。

3 結論

以脫脂及甲醇超聲提取獲得梔子提取物為原料，經正丁醇萃取富集梔子苷。通過響應面法獲得最優(yōu)萃取工藝參數(shù)為萃取時間30 min，萃取溫度45℃，梔子苷質量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，在此條件下，梔子苷萃取率為30.27%，與預測值30.18%無顯著性差異（p＞0.05）。通過正丁醇萃取富集梔子醇提取物中梔子苷，將為梔子的開發(fā)利用提供技術參考。