劉 靜，戴鳳翠，李紅敏，盧發(fā)強(qiáng)，宗成國(guó)

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116001)

呼吸道合胞病毒(RSV)，屬副粘液病毒科，肺炎病毒亞科屬，是嬰幼兒呼吸道感染的最常見(jiàn)致病原因[1]。嚴(yán)重RSV感染導(dǎo)致的肺組織免疫病理學(xué)改變與Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答有關(guān)[2,3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Th2型細(xì)胞因子包括IL-13可能是RSV誘導(dǎo)的哮喘樣癥狀和哮喘加重的原因[4-6]。

作為Th2型細(xì)胞因子的主要成員，IL-13在Th2型炎癥中起關(guān)鍵作用。在RSV疫苗增強(qiáng)型疾病中IL-13對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞起募集作用[7]，對(duì)于人嗜酸性粒細(xì)胞IL-13起趨化作用而且能夠促進(jìn)人嗜酸性粒細(xì)胞存活[8]。許多細(xì)胞包括固有免疫細(xì)胞是IL-13的細(xì)胞來(lái)源[9,10]。天然輔助細(xì)胞，現(xiàn)也被稱為Ⅱ型固有免疫細(xì)胞(ILC2)，第一次由Moro等提出，在促炎性因子IL-25和IL-33的刺激下，能夠高表達(dá)Th2型細(xì)胞因子[11-13]。研究表明,RSV感染后模型鼠肺組織內(nèi)產(chǎn)生大量IL-33及Th2型細(xì)胞因子IL-13，同時(shí)伴隨NHC細(xì)胞數(shù)目的增多；天然輔助細(xì)胞通過(guò)IL-33/ST2分泌IL-13。

IL-33介導(dǎo)的下游信號(hào)通路通過(guò)ST2和IL-1R輔助蛋白(IL-1RACP)受體調(diào)控。 在體內(nèi)模型中，IL-1RACP或者ST2缺乏的小鼠對(duì)IL-33給藥無(wú)炎癥反應(yīng)[14]。 IL-33結(jié)合ST2受體導(dǎo)致MYD88結(jié)合蛋白的激活和募集，以及IL-1R相關(guān)激酶1(IRAK1)、 IRAK4和TNFR相關(guān)蛋白6的激活和募集[15,16],這種信號(hào)級(jí)聯(lián)進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和MAPK的激活[17]。已有研究報(bào)道，在體外條件下，IL-33通過(guò)其受體ST2激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)極化的Th2細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子[18]，而對(duì)于NF-κB和MAPK信號(hào)通路在NHC細(xì)胞因子IL-13分泌機(jī)制中所起的作用目前尚無(wú)報(bào)道,尤其在RSV感染模型中。

本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究 NF-κB 和 MAPK 信號(hào)通路在天然輔助細(xì)胞 IL-13 分泌機(jī)制中的作用。本研究的開(kāi)展可能為在 RSV 誘發(fā)疾病中研究 NHC 的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制調(diào)節(jié)提供新的見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 材料﹑試劑

1.1.1病毒 人RSV A2病毒在Hep-2細(xì)胞株中傳代[19]，TCID50表示病毒滴度。

1.1.2小鼠 無(wú)菌6-8周BALB/c小鼠購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠食用無(wú)菌的食物和水，且處于無(wú)菌環(huán)境中。小鼠首先用水合氯醛(0.229 mg/g 體重)麻醉，而后鼻腔吸入含2×106TCID50 RSV病毒的PBS,陰性對(duì)照組小鼠鼻腔吸入等量的無(wú)菌PBS。

1.1.3試劑 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)于TAKARA公司。流式封閉抗體和流式抗體購(gòu)于eBioscience公司，破膜液等購(gòu)于BD公司。

1.2 方法

1.2.1制備肺的單細(xì)胞懸液 小鼠麻醉后用20 ml PBS心臟灌洗去除血管中的血。小鼠肺組織剪碎，懸于10 ml 10% FBS-RPMI 1640中，加入200 μg/ml collagenase D和40 μg/ml DNase I，37℃搖床震蕩消化1 h。紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，2% FBS-PBS重懸細(xì)胞。

1.2.3天然輔助細(xì)胞的體外刺激培養(yǎng) 流式分選肺天然輔助細(xì)胞，IL-33(30 ng/mL) 和IL-2 (10 ng/mL) 體外刺激培養(yǎng)24 h，離心棄上清，加入1 ml Trizol，提取細(xì)胞RNA后逆轉(zhuǎn)錄cDNA，用于檢測(cè)NHC中IL-13﹑NF-κB和p38 mRNA水平。 在IL-33刺激培養(yǎng)前1 h加入NF-κB特異性抑制劑(BAY11-7082)和p38特異性抑制劑(SB203580)，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)NHC中IL-13 mRNA水平。

1.2.4檢測(cè)基因水平的表達(dá) 分選天然輔助細(xì)胞后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR檢測(cè)IL-13﹑NF-κB和p38的表達(dá)水平。所用到的特異性引物：IL-13-F,5′-AGCATGGTATGGAGTGTGGA-3′,IL-13-R,5′-TTGCAATTGGAGATGTTGGT-3′;β-actin-F,5′-CAACGAGCGGTTCCGATG-3′,β-actin-R,5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′;NF-κB-F,5′-AAAGGCCAAAAACGCTACCT-3′,NF-κB-R,5′-GGCTCAAAACGAGCTCTCAC-3′;p38-F,5′-TCGACATCTGGTCTGTTGGT-3′,p38-R,5′-GGTCAGCTGGTCCAGGTAGT-3′。

1.2.5流式磷酸化抗體染色 流式分選RSV感染后3天NHC， 2×104/孔鋪板，IL-33(30 ng/mL) 和IL-2(10 ng/mL) 體外刺激培養(yǎng)0、15、30、60分鐘后， 離心清洗后收取細(xì)胞， 加入磷酸化NF-κB和p38流式抗體進(jìn)行染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IL-33在天然輔助細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子IL-13中的作用

我們的前期研究表明RSV感染后模型鼠肺組織內(nèi)產(chǎn)生大量IL-33[20]。IL-33屬IL-1家族，具有下調(diào)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，上調(diào)Th2細(xì)胞產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL-5和IL-13的作用[21]。 已有研究報(bào)道天然輔助細(xì)胞在IL-33的作用下產(chǎn)生IL-13[11]。RSV感染后3天，利用流式分選技術(shù)分選NHC， Real-time PCR分析NHC 表達(dá)IL-13mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSV感染后3天，在內(nèi)源性IL-33的作用下，NHC中IL-13 mRNA水平呈現(xiàn)有意義的升高(圖1A)；并且，分選RSV感染3天NHC，在體外條件下IL-33刺激培養(yǎng)，NHC中IL-13 mRNA水平升高顯著(圖1B)。以上結(jié)果說(shuō)明，在IL-33作用下NHC分泌Th2型細(xì)胞因子IL-13。

2.2 NF-κB信號(hào)通路在天然輔助細(xì)胞分泌IL-13中的作用

為證明NF-κB信號(hào)通路在NHC分泌IL-13中的作用，我們首先在體內(nèi)條件下檢測(cè)NF-κB mRNA水平，如圖2A結(jié)果所示:在RSV感染3天NF-κB mRNA水平達(dá)到峰值，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；然后我們利用流式分選技術(shù)分選RSV感染后3天NHC， 在IL-33刺激培養(yǎng)前1 h加入NF-κB特異性抑制劑(BAY11-7082)，培養(yǎng)24h后檢測(cè)NHC中IL-13 mRNA水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在BAY11-7082的作用下NHC表達(dá)IL-13 mRNA的水平降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)；另外，IL-33體外刺激能誘導(dǎo)NF-κB的磷酸化(圖2C)。以上結(jié)果表明IL-33能誘導(dǎo)NHC中NF-κB的磷酸化，但NF-κB信號(hào)通路可能不介導(dǎo)NHC分泌IL-13。

圖1 IL-33在天然輔助細(xì)胞分泌IL-13中的作用

注：將BALB/c小鼠經(jīng)鼻內(nèi)感染RSV病毒，接種劑量為每只小鼠2×106TCID50，并在RSV感染后的0，3，5天從BALB/c小鼠的肺組織中分離肺NHC。(A)通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)肺NHC中IL-13 mRNA的表達(dá)水平。(B)通過(guò)流式細(xì)胞儀分選肺天然輔助細(xì)胞，30 ng/ml IL-33和10 ng/ml IL-2體外刺激培養(yǎng)24 h，檢測(cè)肺天然輔助細(xì)胞中IL-13 mRNA的表達(dá)水平。**P<0.01,***<0.001

圖2 NF-κB信號(hào)通路在NHC分泌IL-13中的作用

注：(A) RSV感染后0，3，5天，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)肺NHC中NF-κB mRNA的表達(dá)水平。 (B)RSV感染后3天，從BALB/c小鼠的肺組織中分離出肺NHC，IL-33體外刺激前，用NF-κB特殊抑制劑(BAY11-7082，10 μM)處理NHC后檢測(cè)NHC中IL-13 mRNA的表達(dá)。(C)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)NHC中NF-κB的磷酸化水平。**P<0.01

2.3 p38信號(hào)通路對(duì)天然輔助細(xì)胞分泌IL-13至關(guān)重要

為明確p38信號(hào)通路在NHC分泌IL-13機(jī)制中的作用，我們檢測(cè)NHC中p38 mRNA水平及p38磷酸化情況。如圖3所示，RSV感染后NHC中p38 mRNA水平呈現(xiàn)有意義的升高，且在RSV感染后3天達(dá)到峰值(圖3A)；并且，利用SB203580特異性抑制p38信號(hào)通路，NHC分泌IL-13的水平顯著降低(圖3B)，與此同時(shí)，在IL-33刺激的15、30 min，NHC中磷酸化p38百分比同0分鐘相比呈現(xiàn)有意義的升高(圖3C)。以上結(jié)果說(shuō)明，p38信號(hào)通路介導(dǎo)天然輔助細(xì)胞分泌IL-13。

3 討論

呼吸道合胞病毒感染是哮喘癥狀加重的重要誘因，然而感染機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，NHC在急性過(guò)敏性氣道炎癥中起重要作用[22,23]。RSV感染后，ILC2是Th2型細(xì)胞因子的IL-13重要來(lái)源[20]。本研究中，通過(guò)應(yīng)用BALB/c小鼠感染呼吸道合胞病毒的模型，我們發(fā)現(xiàn)RSV感染后，天然輔助細(xì)胞中IL-13mRNA水平升高，且在感染后3天達(dá)到峰值(圖1A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-33對(duì)天然輔助細(xì)胞的作用，我們首先分選天然輔助細(xì)胞，而后 IL-33體外刺激，檢測(cè)天然輔助細(xì)胞分泌IL-13的水平。結(jié)果顯示，在外源性IL-33的作用下，天然輔助細(xì)胞分泌IL-13的水平同對(duì)照組相比也呈現(xiàn)有意義的升高(圖1B)，由此表明，在IL-33作用下，天然輔助細(xì)胞分泌IL-13。

圖3 p38信號(hào)通路介導(dǎo)天然輔助細(xì)胞分泌IL-13

注：(A)RSV感染后0，3，5天，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)肺NHC中p38 mRNA的表達(dá)水平。 (B)RSV感染后3天，從BALB/c小鼠的肺組織中分離出肺NHC， IL-33體外刺激前，用p38特殊抑制劑(SB203580，10 μM)處理NHC后檢測(cè)NHC中IL-13 mRNA的表達(dá)。(C)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)NHC中p38的磷酸化水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

目前，對(duì)NHC 生物學(xué)功能的研究，主要集中于其在 IL-33作用下產(chǎn)生的 Th2 型細(xì)胞因子 IL-5 和 IL-13[13,20]對(duì)氣道炎癥性疾病的作用，尤其在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。而對(duì)于 IL-33所激活下游信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制研究國(guó)內(nèi)少見(jiàn)報(bào)道，尤其在RSV感染模型中。 IL-33通過(guò)由IL-33Rα 鏈(ST2L)和IL-1R輔助蛋白觸發(fā) NF-kB 和 MAPK 的激活[24-26]。 研究表明IL-33通過(guò)結(jié)合到T1/ST2導(dǎo)致p38 以及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[27]。 在體外條件下，IL-33通過(guò)其受體ST2激活 NF-κB 和 MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)極化的Th2細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子。本研究中，RSV感染后，天然輔助細(xì)胞中IL-13升高的同時(shí)，NF-κB和p38 mRNA水平同對(duì)照組相比呈現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高(圖2A，圖3A)， 并且，在體外條件下，IL-33能誘導(dǎo)NF-κB和p38磷酸化(圖2C，圖3C)，由此我們推測(cè)IL-33可能激活下游信號(hào)分子NF-κB和p38進(jìn)而介導(dǎo)其IL-13的分泌。的確，利用SB203580特異性抑制p38信號(hào)通路，NHC分泌IL-13的水平顯著降低(圖3B)；然而，在NF-κB特異性抑制劑BAY11-7082的作用下NHC表達(dá)IL-13 mRNA的水平降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。 由此表明，p38信號(hào)通路介導(dǎo)天然輔助細(xì)胞分泌IL-13。另外，對(duì)于IL-33與其受體ST2結(jié)合激活的MAPK家族的其他信號(hào)分子如JNK， ERK在本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高(數(shù)據(jù)未提供)。已有報(bào)道指出從腸系膜分離的NHC在IL-33作用下能夠使NF-κB和p38磷酸化，但p38介導(dǎo)其分泌IL-5﹑IL-6和IL-13，這與我們的研究結(jié)果相一致[18,28]。

綜上，本研究通過(guò)一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明天然輔助細(xì)胞通過(guò)p38信號(hào)通路分泌IL-13。作為Th2型細(xì)胞因子的主要成員，IL-13的過(guò)度表達(dá)與疾病嚴(yán)重性相關(guān)，例如哮喘。本研究為在RSV感染疾病中研究NHC的胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的見(jiàn)解。