李春艷，杜振華，劉 錦

(1.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，天津300190；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，天津300162)

目前血培養(yǎng)是診斷的血流感染(BSI，bloodstream infection)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于耗時(shí)長(zhǎng)，其診斷效率低下，而C反應(yīng)蛋白(CRP，C reactive protein)、前降鈣素原(PCT，Procalciton)等感染指標(biāo)影響因素多且成本高[1]，因此尋找能夠在早期快速方便診斷BSI的指標(biāo)一直是感染診療的迫切需求。高熒光強(qiáng)度淋巴細(xì)胞(HFLC，high fluorescence lymphocytes)和不成熟粒細(xì)胞(IG，immature granulocytes)是新一代Sysmex血細(xì)胞分析儀提供的研究參數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)IG百分比可以預(yù)測(cè)新生兒膿毒血癥和血液感染[2]，也有研究發(fā)現(xiàn)其在成人感染患者中水平升高[3-5]。本研究旨在探索Sysmex XE-5000全自動(dòng)血常規(guī)分析儀提供的IG和HFLC參數(shù)對(duì)ICU中腦出血患者不同程度感染(局部感染和血流感染)的區(qū)分能力，并利用Logistic回歸分析建模，評(píng)估其與PCT、CRP指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)是否能提高對(duì)血流感染的診斷能力。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院2014年3月至2015年7月腦科ICU病房腦出血住院患者64例，其中男50名，女14名，年齡平均51.67±14.76歲，包含19例未感染患者(NOI，至少連續(xù)7天痰、尿、腦脊液培養(yǎng)均為陰性，并結(jié)合影像學(xué)特征、體溫及臨床癥狀判定)；27例局部感染患者(LCI，痰或尿標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性，而血培養(yǎng)陰性)和18例BSI患者(血培養(yǎng)陽(yáng)性)。血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本中可見(jiàn)人葡萄球菌、白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌、銅綠假單胞菌等。以同期健康體檢中心體檢合格的121名健康人作為對(duì)照組(HC)，其中男95名，女26名，年齡平均56±10.40歲。各組間年齡、性別、職業(yè)構(gòu)成等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例資料中排除其它自身免疫性疾病、傳染性疾病(如HBV、HCV、HIV感染患者)、腫瘤、外傷、貧血、嚴(yán)重肝腎損害等。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1樣本采集與處理 樣本的采集和檢測(cè)連續(xù)7天留取可能引發(fā)感染的腦出血患者標(biāo)本(包括血液、尿液或痰液標(biāo)本)，以評(píng)估患者的感染情況。記錄患者首次血液培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)的HFLC、IG、PCT、CRP，1-3-β-DG和Endotoxin參數(shù)。健康對(duì)照只檢測(cè)HFLC和IG。所取血液樣本(5 ml)， 3 500 r/min離心10 min后取血清檢測(cè)。采用全自動(dòng)免疫速率散射比濁法測(cè)定C反應(yīng)蛋白(CRP)。采用免疫熒光法檢測(cè)PCT。采用光濁度法檢測(cè)1-3-β-DG和Endotoxin。白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、高熒光強(qiáng)度淋巴細(xì)胞(HFLC)和未成熟粒細(xì)胞(IG)檢測(cè)在Sysmex XE-5000全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀上進(jìn)行。所有試驗(yàn)固定操作人員，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程說(shuō)明操作。試劑、質(zhì)控品及校準(zhǔn)品均在有效期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前用各自的校準(zhǔn)物定標(biāo)，試驗(yàn)中采用各自配套的質(zhì)控物對(duì)儀器運(yùn)行狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。

1.2.2儀器與試劑 Sysmex XE-5000全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀及其原裝配套試劑(包括在線質(zhì)控品)均來(lái)自日本希森美康公司。德國(guó)SIMENS BNII 全自動(dòng)免疫散射比濁儀及其配套試劑(包括質(zhì)控品)。法國(guó)梅里艾VIDAS全自動(dòng)免疫熒光酶標(biāo)儀及其配套前降鈣素原(PCT)試劑。北京金山川MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)及與其配套的1,3-β-D葡聚糖(1,3-β-DG)檢測(cè)試劑和脂多糖(LPS)檢測(cè)試劑。靜脈真空采血管采用廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)的EDTA-2K抗凝管和普通干燥管。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

NOI組[(0.0556±0.0041) ×109/L，(0.0114±0.0057) ×109/L]、LCI組[(0.0857±0.0103)×109/L，(0.0102±0.0063)×109/L]、BSI組[(0.1503±0.0208)×109/L，(0.0255±0.0047)×109/L]的IG和HFLC水平均顯著高于健康對(duì)照組[(0.0113±0.0035)×109/L，(0.0011±0.0024)×109/L](P<0.05)；BSI組兩參數(shù)水平顯著高于LCI組(P<0.05)；但LCI組和NOI組間兩參數(shù)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1(a、b)。NOI組(13.58±5.61)×10。9/L、LCI組(14.83±7.06)×109/L、BSI組(13.46±7.69)×109/L WBC水平顯著高于健康對(duì)照組(5.9±1.79)×109/L(P<0.05)，但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組間HFLC(a)、IG(b)、CRP(c)、PCT(d)水平比較

2.2 腦出血患者各組間CRP、PCT水平比較

NOI組、LCI組、BSI組間CRP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分別為(46.7±11.92) mg/L、(74.07±11.15) mg/L、(79.29±24.74) mg/L。BSI組PCT水平(11.96±11.56) ng/mL顯著高于NOI組(0.72±0.47) ng/mL和LCI組(2.82±4.68) ng/mL(P<0.05)，但后兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1，見(jiàn)圖1(c、d)。

表1 各組檢測(cè)參數(shù)比較

注：*與健康對(duì)照組相比P<0.05；#與未感染組相比P<0.05；△與局部感染組相比P<0.05。

2.3 IG、HFLC、CRP、PCT及HFLC和PCT聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BSI的診斷效能分析

五參數(shù)的ROC曲線下面積為分別為0.725(0.580,0.869)、0.708(0.555,0.860)、0.551(0.374,0.728)、0.808(0.680,0.936)、0.841(0.725,0.957)。當(dāng)界值設(shè)為大于等于0.2343×109/L時(shí)，IG的靈敏度和特異度分別為100%和42.2%；當(dāng)界值設(shè)為大等于0.1573×109/L時(shí)，HFLC的靈敏度和特異度分別為57.1%和77.8%；當(dāng)界值設(shè)為大于等于0.9899時(shí)，PCT的靈敏度和特異度分別為92.9%與62.2%。HFLC和PCT聯(lián)合檢測(cè)，其靈敏度和特異性與單獨(dú)檢測(cè)PCT無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

圖2 IG,HFLC,CRP,PCT及HFLC和PCT聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BSI的診斷能力比較

2.4 IG、HFLC與CRP、PCT、LPS、1,3-β-DG的相關(guān)性

HFLC與1-3-β-DG正相關(guān)(r=0.346,P<0.05)，與其它參數(shù)無(wú)相關(guān)性。IG與PCT正相關(guān)(r=0.284,P<0.05)，與其它參數(shù)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 HFLC、IG與各參數(shù)相關(guān)系數(shù)

2.5 HFLC、IG、PCT、CRP的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析各參數(shù)見(jiàn)表3，發(fā)現(xiàn)只有HFLC和PCT與模型的預(yù)測(cè)能力顯著相關(guān)(P<0.05)。得到Logistic回歸方程為P=1/(1+e-3.22+0.12HFLC+0.75PCT) ，擬合ROC曲線獲得HFLC與PCT聯(lián)合聯(lián)合檢測(cè)時(shí),對(duì)腦出血患者BSI的診斷準(zhǔn)確性(ROC曲線下面積)達(dá)到0.871(0.766,0.977)，界值為0.181時(shí),敏感度增加到85.7%,特異度為75.6%。

表3 HFLC、IG、PCT、CRP Logistic回歸分析模型參數(shù)

3 討論

Sysmex XE-5000全自動(dòng)血液分析儀器通過(guò)新增的核酸熒光染色通道與散射光通道結(jié)合可以給出新的研究參數(shù)：高熒光強(qiáng)度淋巴細(xì)胞(HFLC)[5]和不成熟粒細(xì)胞(IG)，已有研究證實(shí)其對(duì)感染性疾病的診斷有一定的意義[3,6，7]。本研究發(fā)現(xiàn)BSI組患者IG、HFLC計(jì)數(shù)較非BSI組高，與已有報(bào)道的結(jié)果一致[4,6,9，10]。但是IG、HFLC未能區(qū)分LCI組和NOI組，這可能是由于本研究選擇的腦出血患者早期的創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，掩蓋了IG、HFLC的早期變化。這點(diǎn)也可以反映在CRP指標(biāo)上，本研究發(fā)現(xiàn)BSI組、LCI組、NOI組的CRP差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與一些報(bào)道的研究結(jié)果不同[6,11]。 PCT是已被證明的能夠預(yù)測(cè)BSI的標(biāo)志物[12,13]，本研究發(fā)現(xiàn)其診斷效能最高。HFLC和IG的ROC曲線下面積均>0.7表明二者判斷BSI效能均較好。IG的靈敏度好但特異度差，HFLC則相反，可見(jiàn)IG具有較好的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值，而HFLC則具有一定的陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值。這可能是因?yàn)锽SI主要由細(xì)菌感染引發(fā)，粒細(xì)胞(包括IG)對(duì)此比較敏感，而HFLC反映的是機(jī)體在淋巴細(xì)胞受激發(fā)后的反應(yīng)狀態(tài)。在利用Logistic回歸分析建立HFLC、IG、CRP、PCT 4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，HFLC對(duì)PCT的診斷效能有明顯的增幅作用，IG則沒(méi)有。造成這個(gè)結(jié)果，一方面可能是由于PCT與IG所指示的機(jī)體感染反應(yīng)功能重疊(IG與PCT相關(guān))，造成IG無(wú)法為PCT提供額外的診斷信息；另一方面則是由HFLC所代表的細(xì)胞決定的，研究發(fā)現(xiàn)HFLC反映外周血中產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞[14]，且這部分漿細(xì)胞在感染早期通過(guò)非T細(xì)胞依賴的B淋巴細(xì)胞激活途徑產(chǎn)生。血流感染時(shí)，微生物直接刺激B淋巴細(xì)胞增殖與復(fù)制，在此過(guò)程中被T淋巴細(xì)胞識(shí)別，使其中一部分抑制性T淋巴細(xì)胞激活后大量增殖轉(zhuǎn)化，細(xì)胞合成蛋白和核酸增強(qiáng)，也表現(xiàn)為HFLC計(jì)數(shù)的增高[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)LPS與CRP、PCT、IG、HFLC均無(wú)相關(guān)性，可見(jiàn)IG與HFLC與CRP、PCT指標(biāo)一樣與感染細(xì)菌的種類無(wú)關(guān)。而HFLC與1-3-β-DG正相關(guān)，可能與真菌表面1-3-β-DG在機(jī)體早期免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用有關(guān)。但由于分組比例較少，本結(jié)論有一定的誤差，這點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究。

隨著流式技術(shù)與傳統(tǒng)血常規(guī)分析技術(shù)的結(jié)合，現(xiàn)代血常規(guī)分析儀提供越來(lái)越豐富的細(xì)胞相關(guān)參數(shù)，但是其臨床應(yīng)用還停留在傳統(tǒng)的分類計(jì)數(shù)模式當(dāng)中，如何發(fā)掘這些新參數(shù)的臨床價(jià)值，為臨床疾病的診療提供更便捷、豐富的信息，應(yīng)當(dāng)成為檢驗(yàn)工作者思考和解決的問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)IG和HFLC計(jì)數(shù)可以作為臨床上血流感染的判斷提供幫助，IG提供一定的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值，而HFLC則提供一定的陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值。HFLC與PCT聯(lián)合檢測(cè)可以提高血流感染的診斷效率。血細(xì)胞計(jì)數(shù)是臨床患者的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，隨著新一代血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的普及，IG、HFLC參數(shù)的獲取便捷且不會(huì)產(chǎn)生額外的費(fèi)用。由于血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)較其它感染指標(biāo)的頻率高、門檻低，因此IG、HFLC參數(shù)為血流感染的診斷提供極大的幫助。