劉曉燕 蔣益萍 張嘉寶 王娜妮 辛海量

中圖分類號(hào)R931

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1001-0408（2020）02-0138-06

DOI

10.6039/j .issn.1001-0408.2020.02.03

摘要 目的：建立啤酒花的高效液相色譜（ HPLC）指紋圖譜，并考察與其抗氧化作用的相關(guān)性。方法：色譜柱為DiamonsilC18，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液一乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為358 nm，進(jìn)樣量為2μL。以黃腐酚峰為參照，繪制11批啤酒花藥材樣品的HPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評價(jià)，確定共有峰;以1，1-二苯基一2一三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、2，2-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）自由基清除率為抗氧化作用的藥效指標(biāo)，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸分析以建立譜效關(guān)系，并進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：11批啤酒花藥材樣品共有19個(gè)共有峰，相似度均大于0.830。共指認(rèn)出7個(gè)成分，分別為黃腐酚、類律草酮、律草酮、加律草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮。11批啤酒花均具有清除DPPH和ABTS自由基的作用。譜效關(guān)系分析結(jié)果顯示，啤酒花中黃腐酚、律草酮、類蛇麻酮峰與其抗氧化能力呈正相關(guān)，且變量投影值均大于1。體外抗氧化驗(yàn)證結(jié)果顯示，0.1 mg/mL黃腐酚與0.01 mg/mL維生素C對DPPH自由基的清除作用相當(dāng)，但10.0 mg/mL黃腐酚對ABTS自由基清除作用小于0.1 mg/mL維生素C。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜可用于評價(jià)啤酒花的質(zhì)量;黃腐酚、律草酮和類蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 啤酒花;高效液相色譜法;指紋圖譜;抗氧化;譜效關(guān)系;偏最小二乘法回歸分析

啤酒花（Humulus lupulus L.）為?？迫劜輰俣嗄晟葙|(zhì)蔓生藤本植物，主要分布于我國新疆地區(qū)，以未成熟的雌性球穗花序入藥，具有健胃消食、安神、利尿等功效，可用于治療肺結(jié)核、癔病、失眠、膀胱炎等癥[1]，在我國作為民族藥收載于1977年版《中國藥典》（一部）、《新疆藥用植物志》和《寧夏中藥志》等多部典籍。各典籍均記載了啤酒花的基源和功能主治內(nèi)容，但僅有藥典記載了采用滴定法測定啤酒花浸膏中啤酒花軟樹脂的含量[2-4]。啤酒花含有黃酮類、樹脂類、揮發(fā)油、多酚類及多糖類等多種活性成分[5]，而僅靠滴定法不能全面控制啤酒花中多種活性成分的含量，且目前對于啤酒花的研究大多為對其多酚類或黃酮類成分的分離和結(jié)構(gòu)分析，具有一定的局限性[6-8]。

中藥譜效學(xué)是基于解決中藥活性成分復(fù)雜、藥理作用機(jī)制不明等問題的一門學(xué)科，也是中藥學(xué)質(zhì)量和活性研究的一個(gè)新方向，其可利用多種數(shù)據(jù)分析中藥藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。啤酒花中的黃酮類成分黃腐酚及多酚類成分均具有抗氧化活性[10-11]，但目前尚未見關(guān)于啤酒花中各成分與其抗氧化活性的研究?；诖?，本研究采用高效液相色譜（HPIC）法建立了啤酒花的指紋圖譜，并對其指紋圖譜中的特征峰與清除1，l-二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-連氨-（3一乙基苯并噻唑啉-6一磺酸）二氨鹽（ABTS）自由基作用的相關(guān)性進(jìn)行分析，探討特征峰與其抗氧化活性的相關(guān)性，以闡明其體外抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，旨在為其質(zhì)量控制和抗氧化作用譜效關(guān)系研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型HPLC儀，包括四元梯度系統(tǒng)、二極管陣列檢測器、LC-solution色譜工作站（日本島津株式會(huì)社）;AG285型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-To-ledo公司）;DL-1OOOB型智能超聲波清洗儀（上海之信儀器有限公司）;ELx 800型多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）。

1.2 試劑

黃腐酚對照品（上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20181103.純度：≥98%）;啤酒花浸膏ICE-3（美國釀造化學(xué)家協(xié)會(huì)，含有類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮等6種成分）;維生素C[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號(hào)：RS032884013J，純度：≥99%];DPPH（批號(hào)：STBD2362V）、ABTS（批號(hào)：SLBV6099）均由美國Sigma公司提供;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

啤酒花藥材（編號(hào)：S1～S11）經(jīng)解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室辛海量副教授鑒定為桑科植物啤酒花（H lupulus L.）的雌性球穗花序。藥材樣品來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C.8（250 mm×4.6 mm，5μm）;流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10min， 20% B→25%B; 10～12 min， 25%B→ 75%B; 12～30 min， 75%B→78% B; 30～40 min， 78% B→81% B;40～42 min， 81% B→83%B： 42～60 min， 83% B→90%B）;流速：1.O mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：358 nm;進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液精密稱取黃腐酚對照品26.46mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，得黃腐酚對照品貯備液。精密稱取啤酒花浸膏ICE-3466.27 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，得浸膏貯備液。取上述兩種貯備液各5 mL，置于同- 10 mL量瓶中，混合均勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液取啤酒花藥材樣品適量，粉碎，稱取粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加50%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：300W，頻率：50 kHz）處理30 min，放涼至室溫，再次稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：SII）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以黃腐酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.13%（n=6），相對峰面積的RSD均小于1.47%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S11）適量，分別于室溫下放置O、2、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以黃腐酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.37%（n=7），相對峰面積的RSD均小于2.93%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)取啤酒花藥材樣品粉末（編號(hào)：S11）0.5 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以黃腐酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.41%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.17%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取11批啤酒花藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對11批啤酒花藥材樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價(jià)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果，11批啤酒花藥材樣品的相似度均大于0.830，提示不同產(chǎn)地和不同品種的啤酒花藥材樣品間的化學(xué)成分差異較小。相似度評價(jià)結(jié)果見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)11批啤酒花藥材樣品共有19個(gè)共有峰。以SIO作為參照圖譜，時(shí)間窗口為0.1 min，選擇指紋圖譜中峰形較好的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，采用平均數(shù)法生成對照圖譜，同時(shí)結(jié)合啤酒花藥材樣品和混合對照品的HPLC分析結(jié)果，指認(rèn)出11號(hào)峰為黃腐酚、13號(hào)峰為類葎草酮、14號(hào)峰為葎草酮、15號(hào)峰為加葎草酮、17號(hào)峰為類蛇麻酮、18號(hào)峰為蛇麻酮、19號(hào)峰為加蛇麻酮，詳見圖3。因黃腐酚峰分離度良好、峰面積大且穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，詳見表3、表4。

2.5 抗氧化作用考察

2.5.1 DPPH自由基清除率 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備11批供試品溶液（編號(hào)：S1～11），每批取1 mL，加50%乙醇稀釋制成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液;精密稱取DPPH 4 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL量瓶中，即得濃度為40 μg/mL的DPPH自由基溶液。取上述系列質(zhì)量濃度的供試品溶液各100 μL、DPPH自由基溶液100μL，先后加入至96微孔板中，置于室溫避光處反應(yīng)30min后，采用酶標(biāo)儀于540 nm波長處測定DPPH自由基溶液+系列質(zhì)量濃度供試品溶液的吸光度（As）;取系列質(zhì)量濃度的供試品溶液各100 μL、無水乙醇100 μL，同法反應(yīng)并測得系列質(zhì)量濃度供試品溶液的吸光度（Ac）;取DPPH自由基溶液100 μL、50%乙醇溶液100 μL，同法反應(yīng)并測得DPPH自由基溶液的吸光度（A0）。上述試驗(yàn)均平行操作3次，取平均值，按公式計(jì)算DPPH清除率：DPPH清除率=[A0-（As一Ac）]/A0×1OO%[12-14];采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行非線性回歸，預(yù)測半數(shù)抑制濃度（ICso），結(jié)果見表5。由表5可知，11批啤酒花藥材樣品均具有清除DPPH自由基的能力，其中以昌吉市吉木薩爾縣紅旗農(nóng)場1采集的啤酒花（編號(hào)：S4）抗氧化能力最強(qiáng)。

2.5.2 ABTS自由基清除率 精密稱取ABTS 38.41mg，加水溶解并定容至10 mL量瓶中，制成濃度為7mmol/L的ABTS水溶液，與2.45 mmol/L的過硫酸鉀（K2S208）水溶液混合，于暗處放置12 h以上，使用前加甲醇稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度為0.78～0.82，即得ABTS自由基溶液。取“2.5.1”項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度的供試品溶液各10 μL、ABTS自由基溶液200 μL，先后加入至96微孔板中，置于室溫反應(yīng)10 min，采用酶標(biāo)儀于734 nm波長處測得ABTS自由基溶液+系列質(zhì)量濃度供試品溶液的吸光度（As）;取系列質(zhì)量濃度的供試品溶液10 μL、甲醇200 μL，同法反應(yīng)并測得系列質(zhì)量濃度供試品溶液的吸光度（Ac）;取ABTS自由基溶液200μL、50%乙醇溶液10 μL，同法反應(yīng)并測得ABTS自由基溶液的吸光度Ao。上述試驗(yàn)均平行操作3次，取平均值，按“2.5.1”項(xiàng)下公式計(jì)算ABTS清除率并預(yù)測ICso，結(jié)果見表5。由表5可知，11批啤酒花藥材樣品均具有清除ABTS自由基的能力，其中以阿勒泰市云母二礦采集的啤酒花（編號(hào)：S2）抗氧化能力最強(qiáng)。

2.6 譜效關(guān)系分析

以表5中11批啤酒花藥材樣品的抗氧化活性數(shù)據(jù)為因變量，峰面積為自變量，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸分析。結(jié)果，啤酒花藥材樣品HPLC指紋圖譜中的4～12、14、16～18號(hào)峰面積與其清除DPPH和ABTS自由基的能力呈正相關(guān)，即相應(yīng)成分的相對含量越高，其清除DPPH和ABTS自由基的能力越強(qiáng)，提示該成分是啤酒花清除DPPH和ABTS自由基作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果見圖4。

變量投影（VIP）可解釋自變量對因變量的貢獻(xiàn)程度，VIP值越大，說明該自變量對因變量的貢獻(xiàn)越大，VIP>I時(shí)表示對因變量有顯著貢獻(xiàn)[15]。以DPPH和ABTS自由基的清除率為藥效指標(biāo)，對VIP進(jìn)行分析，篩選出對啤酒花藥材樣品抗氧化能力影響較大的色譜峰（以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)）。結(jié)果，啤酒花藥材樣品對DPPH和ABTS自由基的清除能力從大到小依次分別為黃腐酚（11號(hào)峰）>葎草酮（14號(hào)峰）>類蛇麻酮（17號(hào)峰）和葎草酮（14號(hào)峰）>黃腐酚（11號(hào)峰）>類蛇麻酮（17號(hào)峰），提示相應(yīng)成分在清除DPPH和ABTS自由基過程中具有重要作用，且與啤酒花抗氧化能力呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示黃腐酚、葎草酮和類蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果見圖5。

2.7 黃腐酚體外抗氧化驗(yàn)證試驗(yàn)

2.7.1 DPPH自由基清除率精密稱取黃腐酚對照品50.04 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中;另取上述溶液適量，再分別用甲醇稀釋10、100倍，制成質(zhì)量濃度分別為10.0、1.0、0.1 mg/mL的系列工作溶液。精密稱取維生素C 10 mg，加水溶解并定容至100 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的維生素C溶液。按“2.5.1”項(xiàng)下方法操作并計(jì)算黃腐酚和維生素C對DPPH自由基的清除率，詳見圖6A。由圖6A可知，黃腐酚在質(zhì)量濃度0.1～10.O mg/mL范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除率由42.6%增加至88.8%，且0.1 mg/mL黃腐酚與0.01 mg/mL維生素C對DPPH自由基的清除率相當(dāng)（P=0.050），提示黃腐酚具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，是啤酒花具有清除DPPH自由基作用的主要成分之一。

2.7.2 ABTS自由基清除率取“2.7.1”項(xiàng)下系列工作溶液各適量;另精密稱取維生素C 10.02 mg，加水溶解并定容至10 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的維生素C溶液。按“2.5.1”項(xiàng)下方法操作計(jì)算黃腐酚和維生素C對ABTS自由基的清除率，詳見圖6B。由圖6B可知，在質(zhì)量濃度0.1～10.O mg/mL范圍內(nèi)，以10.O mg/mL的黃腐酚對ABTS自由基的清除率最高，為33.5%，但小于0.1 mg/mL維生素C對ABTS自由基的清除率;結(jié)合圖5B，提示啤酒花藥材樣品在清除ABTS自由基時(shí)葎草酮的作用最大，是其具有清除ABTS自由基作用的主要成分之一。

3 討論

本研究采用HPLC法建立了啤酒花藥材樣品的指紋圖譜，該方法精密度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，能夠同時(shí)檢測啤酒花中的多種有效成分。本研究前期分別考察了乙腈一水、甲醇一水不同流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果顯示，以乙腈一水為流動(dòng)相時(shí)的分離效果優(yōu)于甲醇一水，但存在色譜峰拖尾現(xiàn)象;隨后在水相中加入0.1%磷酸后，色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到改善。

DPPH法和ABTS法是常用的檢測化合物或植物提取物抗氧化活性的方法[16]，因此本研究以DPPH和ABTS自由基的清除率來評價(jià)啤酒花藥材樣品的抗氧化能力。結(jié)果顯示，11批啤酒花藥材樣品均具有清除DPPH和ABTS自由基的能力，分別以昌吉市吉木薩爾縣紅旗農(nóng)場1和阿勒庫市云母二礦采集的啤酒花藥材樣品的抗氧化能力最強(qiáng)。

偏最小二乘回歸法主要用于多因變量對多自變量的回歸建模[17]，能較好地解決樣本量少于變量的問題[18]。本研究采用偏最小二乘回歸法分析了啤酒花藥材樣品色譜峰與其抗氧化作用的相關(guān)性。結(jié)果顯示，啤酒花藥材樣品指紋圖譜中黃腐酚（11號(hào)）、葎草酮（14號(hào)）、類蛇麻酮（17號(hào)）與DPPH和ABTS自由基清除率呈正相關(guān)，推測上述3種成分可能為啤酒花藥材樣品具有抗氧化作用的潛在藥效物質(zhì)。體外抗氧化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1 mg/mL黃腐酚與0.01 mg/mL維生素C對DPPH自由基的清除率相當(dāng)，但10.0 mg/mL黃腐酚對ABTS自由基清除率小于0.1 mg/mL維生素C。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜可用于評價(jià)啤酒花的質(zhì)量，黃腐酚、葎草酮和類蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-06-27修回日期：2019-12-10）

（編輯：陳宏）

△基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.U1603283）

*碩士研究生。研究方向：中藥藥理學(xué)。E-mail：nmulxy@163，com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥資源、中藥（抗骨質(zhì)疏松）藥理學(xué)。電話：021-81871300。E-mail：hailiangxin@163.com