喬利杰 李彬# 王新陸 謝世陽 高原 朱明軍 王永霞

中圖分類號R285.5

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（2020）02-0149-05

DOI l0.6039/j.issn.1001-0408.2020.02.05

摘要 目的：探討參附益心方對缺氧原代心肌細胞脂肪酸利用的影響及其可能機制。方法：取新生l-3d的SD大鼠心尖部組織，進行原代心肌細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定，并將細胞隨機分為正常組、模型組、輔酶Q.。組（陽性對照，1X10^-4mol/L）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL）。除正常組外，其余各組細胞均于5%02、5qoCO2、90%N2條件下培養(yǎng)6h以復(fù)制缺氧損傷模型。缺氧6h后，采用熒光素酶發(fā)光法檢測各組細胞中三磷酸腺苷（ATP）的含量，采用Westem blotting法檢測其脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARa、PPARp/8）的表達情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組細胞中ATP含量以及FAT/CD36蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細胞中ATP含量均顯著升高，而輔酶010組細胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細胞中PPARa、PPARp/8蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：參附益心方可通過抑制FAT/CD36、PPARa、PPARp/8蛋白的表達來抑制缺氧原代心肌細胞的脂肪酸利用，改善其能量代謝。

關(guān)鍵詞 缺氧;原代心肌細胞;脂肪酸;代謝;參附益心方

心力衰竭（以下簡稱“心衰”）是由于心臟收縮或舒張功能異常，導(dǎo)致排血量不能滿足機體正常需求而引發(fā)的以氣喘、乏力、水腫為主要表現(xiàn)的一系列臨床綜合征，為多種心臟疾病發(fā)展的最終階段。有學(xué)者認為，心肌維持正常生理活動所需的能量得不到滿足或代謝失于平衡，可引起心臟結(jié)構(gòu)與功能受損從而導(dǎo)致超負荷心肌損害，進一步引發(fā)心衰[1]。由此可見，改善心肌能量代謝對緩解心衰患者的癥狀至關(guān)重要。脂肪酸是心肌細胞產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的主要底物，有動物實驗及臨床研究證實，抑制脂肪酸利用可改善心肌能量代謝，延緩心衰病程進展[2-3]。

參附益心方為治療心衰的經(jīng)驗方。有不少研究證明，該方可改善慢性心衰模型大鼠的心功能，降低其血清心房鈉尿肽（ANP）、B型腦鈉肽（BNP）和心肌血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平，下調(diào)心肌細胞及其線粒體中活性氧（ROS）的表達，并上調(diào)ATP、肌酸激酶（CK）的含量，提高心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶活性，從而達到緩解心衰癥狀的目的[4-6]。但目前有關(guān)該方對脂肪酸利用的影響尚未明確。為此，本研究擬建立缺氧原代心肌細胞模型，觀察參附益心方對其脂肪酸利用的影響，并初步探討可能的作用機制，以期為該方治療慢性心衰提供更有力的理論依據(jù)。

l 材料

1.1 儀器

BCM-IOOOA型生物超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;RC0-3000TVBB型C02培養(yǎng)箱（美國Revco公司）;JA203型電子分析天平（上海?？惦娮觾x器廠）;TDL-50B型低速臺式大容量離心機（北京醫(yī)用離心機廠）;CK40型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;DMI3006型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）;MK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

參附益心方浸膏干粉（山東步長制藥股份有限公司，批號：131101，規(guī)格：1g干粉相當于生藥總量9.5 g）;輔酶Q10片[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號：H10930021，規(guī)格：10 mg];心肌細胞消化液（含胰蛋白酶0.16 g、氯化鈉1.6 g、碳酸氫鈉0.070 6 g、葡萄糖0.198 2g、氯化鉀0.059 6 g、羥乙基哌嗪乙磺酸0.4 g.ddH20 200mL，批號：T1320）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：12100）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：P1020）、RIPA蛋白裂解液（批號：ROOIO）、蛋白上樣緩沖液（批號：P1015）、CCK-8試劑（批號：CA1210）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、ECL發(fā)光液（批號：PEOOIO）均購自北京索萊寶科技有限公司;溴脫氧尿核苷（Brdu，批號：B9285）、4 ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號：D9542）均購自美國Sigma公司;YOYO-I染料（批號：Y3601）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：11752050）、擴增試劑盒（批號：11744500）均購自美國Invitrogen公司;Opti-MEM培養(yǎng)基（批號：31985088）、胰蛋白酶（批號：27250018）均購自美國Gibco公司;兔源心肌肌鈣蛋白I（cTn I）多克隆抗體（批號：BM1765）、SABC-FITC標記山羊抗兔IgG二抗（批號：SA1064）均購自武漢博士德生物工程有限公司;0.4%臺盼藍染色液（華美生物工程有限公司，批號：C0040）;ATP檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：11699695001）;兔抗大鼠脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FATICD36）多克隆抗體（批號：ab64014）、兔抗大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARa）多克隆抗體（批號：ab24509）、兔抗大鼠PPARβ/δ多克隆抗體（批號：ab23673）均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司;兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（批號：10494-1-AP）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG=抗（批號：SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司，批號：04-OO1-1A）;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，新生1～3 d，雌雄不限，體質(zhì)量約5～6 g，由河南省動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2015-0005。

2 方法

2.1 藥液制備

2.1.1參附益心方藥液參考本課題組已發(fā)表文獻[6]，稱取參附益心方浸膏干粉0.25 g，用DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL稀釋，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過后，制得質(zhì)量濃度為25mg/mL（以浸膏干粉質(zhì)量計）的藥液。需現(xiàn)用現(xiàn)配。2.1.2輔酶Q.。藥液稱取輔酶Q10片50 mg，用DMEM高糖培養(yǎng)基5.8 mL稀釋，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過后，制得濃度為1X10^-2mol/L的藥液，備用。

2.2 原代心肌細胞分離、培養(yǎng)與鑒定

于無菌條件下取出乳鼠的心尖部，以4℃的PBS清洗3次，隨后將其剪成約1 mm3大小的組織塊，經(jīng)含0.08%胰蛋白酶的心肌細胞消化液吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶內(nèi)，于37℃水浴中孵育6 min，自然沉淀，棄去上清液;再同法反復(fù)消化約7～8次，直到組織塊變成白色透亮狀。取各次自然沉淀后的上清液與等體積含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基混勻，以1 000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀與含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）1 mL混合，用200目篩網(wǎng)濾過，去除未完全消化的組織塊，得細胞懸液。取上述細胞懸液適量，于37℃、5%C02培養(yǎng)箱（下同）中差速貼壁培養(yǎng)90 min后，吸取細胞懸液，以1 000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀與完全培養(yǎng)基充分混合，制成細胞懸液。取少量該細胞懸液，用0.4%臺盼藍染色液染色，在倒置顯微鏡下計數(shù)以計算活細胞比率（染色后，死細胞呈藍色）：活細胞比率=活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）XlOO%。用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為4x10⁵個/mL，加入濃度為0.1 mmol/L的Brdu溶液中以抑制成纖維細胞增殖，培養(yǎng)48h后，棄去上清液，細胞用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24 h;棄去上清液，用PBS清洗3遍，置于4%多聚甲醛溶液中固定10 min，加入cTnI多克隆抗體（稀釋度為1：50），4℃孵育過夜;加入SABC-FITC標記山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1：100），避光孵育2h;加入DAPI避光染色5min，用水溶性封片劑封孔，于熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。隨機選取6個視野，記錄視野內(nèi)細胞總數(shù)目（N1）和心肌細胞數(shù)（n1，即熒光陽性細胞數(shù)），計算心肌細胞比例：心肌細胞比例=n1/N1×1OO%。當該比例超過85%，表明原代心肌細胞純度達到試驗要求，可用以進行后續(xù)研究[6]。

2.3 分組、造模與給藥

取“2.2”項下原代心肌細胞適量接種于96孔板中，將其隨機分成正常組、模型組、輔酶Q.。組（陽性對照，IX10^-4 mol/L，劑量參考本課題組前期CCK-8試驗結(jié)果設(shè)置）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL，以浸膏干粉質(zhì)量計，劑量參考本課題組前期CCK-8試驗結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)3個復(fù)孔。正常組和模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。除正常組外，其余各組細胞均于5% 02、5%C02、90%N2條件下培養(yǎng)6h（缺氧時間根據(jù)本課題組前期YOYO-1染色試驗結(jié)果確定），復(fù)制缺氧損傷模型;正常組細胞則于37℃、5%C02條件下培養(yǎng)6h。

2.4 缺氧原代心肌細胞中ATP含量檢測

按“2.2”項下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細胞后，再按“2.3”項下方法分組、給藥、造模。缺氧6h后，吸棄各孔上清液，用常溫PBS清洗2～3次，每次1min，然后采用熒光素酶發(fā)光法以酶標儀檢測細胞中ATP的含量，嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書重復(fù)操作3次。

2.5 缺氧原代心肌細胞中FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ蛋白表達水平檢測

按“2.2”項下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細胞后，再按“2.3”項下方法分組、給藥、造模。缺氧6h后，采用Western blotting法檢測心肌細胞中FAT/CD36、PPARa、PPARp/8蛋白的表達情況。用RIPA蛋白裂解液300 μL反復(fù)吹打破碎細胞，于4℃、12 000 r/min離心10 min后，取上清液。采用BCA法測定各組細胞的蛋白濃度后，加入4x蛋白上樣緩沖液適量，于100℃煮沸變性5min。取變性后的蛋白進行SDS-PAGE電泳（先于80 V下電泳20 min，再于120V下電泳lh），濕法轉(zhuǎn)膜（恒流：250 mA，時間：2h），以5%脫脂奶粉室溫下封閉2h后，加入相應(yīng)一抗（ FATICD36、PPARa、PPARp/8、GAPDH，稀釋度分別為1：1 000、1：1 000、1：1 000、1：4 000），4 cC孵育過夜;然后加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1：5 000），室溫孵育2h后，經(jīng)ECL發(fā)光液孵育后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上顯影并拍照。采用Image Pro Plus 6.O軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值來表示蛋白的相對表達量。上述試驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.O軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或f檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細胞的鑒定

顯微鏡下可見，原代心肌細胞呈星形或者梭形生長，相互接觸交織成網(wǎng)，且呈現(xiàn)同步搏動，搏動頻率、節(jié)律、強度穩(wěn)定，頻率為70～130次/min。原代心肌鑒定結(jié)果見本課題組已發(fā)表文獻[6]。

3.2 參附益心方對缺氧原代心肌細胞ATP含量的影響

與正常組比較，模型組細胞ATP含量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細胞ATP含量均顯著升高（P<0.05），詳見表1。

3.3 參附益心方對缺氧原代心肌細胞中FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組細胞中FAT/CD36蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05）;而PPARa、PPARβ/δ蛋白的相對表達量與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，輔酶Q.。組細胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細胞中PPARα、PPARβ/δ蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05），詳見圖1、表2。

4 討論

正常生理條件下，心臟運動所需的ATP約有60%～80%來自于脂肪酸代謝，20%～40%來自于碳水化合物（葡萄糖、乳酸、酮體）代謝;在消耗等量氧氣的情況下，脂肪酸代謝途徑比碳水化合物（葡萄糖）代謝途徑產(chǎn)生的ATP少[7]?？梢?，在心衰發(fā)生時，心肌細胞缺血缺氧能量生成不足，而抑制脂肪酸代謝、增加葡萄糖氧化供能將更有助于心肌獲益。

ATP是心臟可直接利用的能量形式，對維持心肌細胞正常代謝和功能具有重要意義;若ATP生產(chǎn)不足，將導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能減弱[8]。輔酶Q.。是線粒體氧化磷酸化的輔酶之一，對線粒體氧化磷酸化和細胞ATP的形成具有重要作用;同時，其可增加心輸出量，降低外周阻力，是治療心衰的常用藥物[9]。因此，本研究選擇輔酶Q10作為陽性對照。

FAT/CD36作為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶，存在于細胞內(nèi)和細胞膜上，參與脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運，并影響機體對脂肪酸的利用[10]。有研究證實，F(xiàn)AT/CD36編碼基因缺失大鼠的脂肪酸攝取率明顯降低，而葡萄糖利用度明顯升高[11]。由此可見，可通過抑制心衰模型大鼠FAT/CD36蛋白的表達來抑制心肌細胞對脂肪酸的利用。PPAR家族為過氧化氫酶增殖物激動受體，其生理功能主要涉及脂肪酸代謝、糖代謝、細胞增殖與分化等[12]。其中，PPARa為機體調(diào)控脂肪酸代謝的重要因子，可參與脂肪酸B氧化過程，活化的PPARa可提高肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（CPT-I）編碼基因的表達，后者可促使脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至線粒體基質(zhì)內(nèi)，然后被機體代謝[13]。Morgan EE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌組織脂肪酸氧化率下調(diào)與PPARa蛋白表達減少有關(guān)。PPARβ/δ可通過調(diào)控CPT-I、過氧化物酶體增殖物激活受體y輔助活化因子la（PGC-1a）等編碼基因的表達，進一步調(diào)節(jié)脂肪酸B氧化過程，其反應(yīng)強度與機體脂肪酸利用呈正比[15]。有研究證實，心衰患者心肌PPARβ/δ蛋白表達下降，脂肪酸氧化將受到抑制，而葡萄糖有氧代謝則會增加[16]。由此可見，抑制PPARa、PPARβ/δ蛋白及其編碼基因的表達對延緩心衰患者的疾病進展至關(guān)重要。

中醫(yī)認為，心衰多因外感風寒、內(nèi)傷飲食、情志失暢、溫熱疫毒日久導(dǎo)致氣血虧虛、心脈失養(yǎng)而引起，病位在心，涉及肺、脾、腎三臟，病機總屬本虛標實、虛實夾雜，本虛為氣虛、陽虛，標實為痰飲、血瘀、水停，治法宜益氣溫陽、活血利水[17]。河南中醫(yī)藥大學(xué)孫建芝教授以此法立方，得參附益心方。方中以人參大補元氣為君，使氣旺血行，水飲痰濕無以停聚;附子、桂枝為臣，溫腎陽、通心脈，使元陽充盛正氣存內(nèi);丹參、赤芍、益母草活血化瘀利水，豬苓、澤瀉、車前子利水滲濕，諸藥配伍使瘀祛水行;葶藶子瀉肺平喘、利水消腫，砂仁、大棗溫補中焦，保護胃氣，為佐使之藥。全方補瀉兼施，標本兼治，扶正不滯邪，利水不傷陰[18]。

本研究選用缺氧細胞模型，模擬心衰時心肌細胞的缺氧狀態(tài)，從ATP含量、脂肪酸利用相關(guān)因子FAT/CD36以及PPARa、PPARp/8蛋白表達等方面來探討參附益心方對缺氧原代心肌細胞脂肪酸利用的影響及可能機制。結(jié)果顯示，模型組細胞中ATP含量及FAT/CD36蛋白的表達均較正常組顯著降低;PPARa、PPARβ/δ蛋白的表達雖有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示心衰發(fā)生時，心肌細胞的能量代謝底物發(fā)生了變化，由優(yōu)先利用脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖[7]，脂肪酸氧化率降低，產(chǎn)能總體減少。與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細胞中ATP含量均顯著升高，輔酶Q10組細胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細胞中PPARα、PPARβ/δ蛋白的相對表達量均顯著降低。這提示參附益心方可進一步抑制缺氧條件下原代心肌細胞的脂肪酸利用，改善其能量供應(yīng)。

綜上所述，參附益心方可通過抑制FAT/CD36及PPARa、PPARβ/δ蛋白的表達來抑制缺氧原代心肌細胞的脂肪酸利用，改善其能量代謝，延緩心衰過程。由于本研究的缺氧時間設(shè)定為6h，處于缺氧早期，而參附益心方對缺氧中晚期原代心肌細胞脂肪酸利用的抑制作用尚未可知，故本課題組后續(xù)將延長缺氧時間來檢測FAT/CD36蛋白、PPARa、PPARβ/δ蛋白及其mRNA的表達，對上述結(jié)論進行驗證;此外，參附益心方對脂肪酸利用其他相關(guān)因子的調(diào)控作用及機制，以及對葡萄糖利用的調(diào)控作用尚未明確，仍有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2019-05-08修回日期：2019-09-02）

（編輯：張元媛）

△基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（ No.81503419，No.813 73853， No.81603466， No.81603432）

*碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病。E-mail：qlj000826@163.com

#通信作者：主治醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病的基礎(chǔ)及臨床。電話：0371-66264771。E-mail：libinnvhai@163.com