吳存兵　邵伯進(jìn)　吳君艷　李家春

摘要：【目的】?jī)?yōu)化生姜黃酮乙醇浸提工藝，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為發(fā)掘生姜作為高附加值產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。【方法】在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（D）為影響因子，應(yīng)用Box-Benhnken中心組合法進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以生姜黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，并研究生姜黃酮的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】生姜黃酮提取率對(duì)4個(gè)因素的二次方程模型為：Y=2.10-0.088A-0.10B+0.30C+0.058D-0.15AB-5.25E-003AC+0.50AD+0.19BC-0.35BD-0.13CD-0.18A2-0.23B2-0.22C2-0.24D2（R2=0.9329），響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型擬合程度較好，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)黃酮提取率有極顯著影響（P<0.01），液料比、浸提時(shí)間與浸提溫度的交互作用影響顯著（P<0.05），各因素對(duì)生姜黃酮提取率影響的排序?yàn)榻釡囟?液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提時(shí)間。生姜黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比30∶1、浸提溫度80 ℃、浸泡時(shí)間3 h，在此條件下實(shí)際測(cè)得的生姜黃酮提取率為2.396%，與預(yù)測(cè)值（2.457%）接近，相對(duì)誤差為2.482%。生姜黃酮在鹽酸和氯化鈉溶液中較穩(wěn)定，而在氫氧化鈉溶液中不穩(wěn)定，在80 ℃以下時(shí)穩(wěn)定性良好，溫度超過80 ℃后出現(xiàn)少量降解?！窘Y(jié)論】通過響應(yīng)面優(yōu)化的生姜黃酮乙醇浸提工藝所需設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作、提取溫度較低、污染小、耗能低且提取率較高，可用于生姜黃酮規(guī)模化提取，同時(shí)生姜黃酮可作為天然穩(wěn)定劑進(jìn)行開發(fā)。

關(guān)鍵詞： 生姜;黃酮;提取;響應(yīng)面分析;穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： S632.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）11-2798-10

Optimization of ethanol extraction of flavonoids from ginger ?and evaluation of its stability

WU Cun-bing1， SHAO Bo-jin1， WU Jun-yan2， LI Jia-chun1

（1Department of Grain Engineering and Food & Drug， Jiangsu Vocational College of Finance & Economics， Huaian， Jiangsu ?223003， China; 2Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College， Huaian， Jiangsu ?223001， China）

Abstract：【Objective】The research focused on ethanol extraction of flavonoids from ginger and their stabilities. It would provide scientific basis for exploiting ginger as high added value product. 【Method】Based on single-factor tests，Box-Benhnken center-composite experiment was carried out with four factors and three levels，including ethanol volume fraction（A），liquid-to-material ratio（B），extraction temperature（C） and extraction time（D）. Extraction rate of flavonoids from ginger（Y） was as response value， response surface methodology was conducted to evaluate the stabilities of flavonoids from ginger. 【Result】Quadratic regression model of the extraction rate of flavonoids from ginger on the four factors was Y=2.10-0.088A-0.10B+0.30C+0.058D-0.15AB-5.25E-003AC+0.50AD+0.19BC-0.35BD-0.13CD-0.18A2-0.23B2-0.22C2-0.24D2（R2=0.9329），which showed good fitting degree. Ethanol volume fraction and the interaction between liquid-to-material ratio and extraction time had extremely significant effects on the flavonoids extraction rate（P<0.01），the liquid-to-material ratio and the interaction between extraction temperature and extraction time had significant influence on it（P<0.05）. The order of the influence of each factor on the extraction rate of flavonoids from ginger was extraction temperature>liquid-to-material ratio>ethanol volume fraction>extraction time. The optimal extraction conditions were ethanol volume fraction 60%，liquid-to-material ratio 30∶1，extraction temperature 80 ℃ and extraction time 3 h. Under these conditions，the extraction yield of flavonoids was 2.396%，which was close to the predicted value（2.457%）， and the relative error was 2.482%. The ?avonoids of ginger was stable in HCl and NaCl solution，on the contrary， it was sensitive in NaOH solution. It was stable under 80 ℃，and a little degradation occurred when the temperature exceeded 80 ℃. 【Conclusion】The optimized process requires simple equipment，low extraction temperature，low pollution，low energy consumption and high extraction rate，which is suitable for the large scale extraction of ginger flavonoids and ginger flavonoids can be developed as a natural stabilizer.

Key words： ginger; flavonoid; extraction; response surface method; stability

Foundation item：National Traditional Chinese Medicine Standardization Project（ZYBZH-C-JS-28）; Major New Drug Development of the Ministry of Science and Technology（2013ZX09402203）; Jiangsu Universities “Qinglan Pro-ject”（2017）;Huaian “533” Talents Project（2017）

0 引言

【研究意義】生姜是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖，多為不規(guī)則圖形，整體呈黃色，既可食用又可藥用，具有活血脈絡(luò)、祛痰的功效，對(duì)脾、肺也有益（匡芮等，2007）。生姜不僅含有姜酚、姜油酮、α-蒎烯、桉油精和黃酮類物質(zhì)（譚建寧等，2013;高紅巖，2016），還有一些微量元素和維生素（吳建華和張麗君，2002）。其中，黃酮可清除人體內(nèi)的自由基，是一種抗氧化劑（鄭裕國(guó)等，2004）。黃酮類化合物在抗腫瘤、抗病毒等方面具有顯著的藥理作用，還可軟化血管，促進(jìn)血液循環(huán)（朱茂田，2006）。在多種常見的中藥中均含有黃酮成分，如丹參、黃芪、葛根和金銀花等（王青云，2010;何軍，2019）。黃酮種類繁多，是一種開發(fā)前景廣闊的天然有機(jī)藥物。因此，研究生姜中總黃酮提取工藝，對(duì)于生姜的綜合利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，科技人員已對(duì)生姜黃酮的提取方法進(jìn)行相關(guān)研究。郭艷華等（2010）以生姜為原料，采用微波法輔助乙醇提取黃酮，并通過避光、紫外光、加熱等方式研究生姜黃酮的穩(wěn)定性;許慶陵等（2012）以生姜加工的廢棄物生姜皮為原料，采用乙醇浸提法提取其總黃酮，在最佳工藝條件[乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、浸提時(shí)間5.5 h、浸提溫度60 ℃、料液比1∶45（g/mL，下同）]下獲得總黃酮提取率0.61%;王宗成等（2015）采用響應(yīng)面法優(yōu)化生姜莖葉總黃酮的提取條件，并發(fā)現(xiàn)生姜莖葉總黃酮體外清除羥基自由基能力強(qiáng)于相同濃度的2，6-二叔丁基對(duì)甲酚;吳玲（2017）采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化生姜黃酮提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在生姜粉過40目篩、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比15∶1（mL/g，下同）、溫度70 ℃的條件下，黃酮提取率為1.52%;孫曉玲（2018）研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶—乙醇結(jié)合法提取的生姜總黃酮提取率高于超聲提取法和回流提取法;羅思玲等（2019）采用超聲輔助甲醇浸提法對(duì)生姜?dú)堅(jiān)锌傸S酮進(jìn)行提取，結(jié)果表明，在最佳提取工藝條件（料液比1∶25、甲醇濃度72%、超聲溫度62 ℃、超聲時(shí)間30 min）下，生姜?dú)堅(jiān)傸S酮提取量為10.42 mg/g?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有不少關(guān)于生姜黃酮提取方法及其活性的研究，但主要集中在生姜鮮姜、生姜皮、生姜莖葉、生姜?dú)堅(jiān)仍稀Ｒ蚱贩N、地域等因素差異，生姜黃酮種類較多，不同溶劑浸提出的黃酮在結(jié)構(gòu)和生理功能上存在差異（梅邢等，2017）。尤其是生姜老姜莖塊提取的黃酮與上述原料有無差異目前尚不知曉，關(guān)于響應(yīng)面設(shè)計(jì)乙醇浸提生姜老姜黃酮工藝及其在不同條件下的穩(wěn)定性研究也鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分光光度法測(cè)定生姜老姜中的總黃酮含量，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化溶劑法提取生姜老姜黃酮的工藝，探究各因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間）及其交互作用對(duì)黃酮提取率的影響，同時(shí)考察生姜黃酮在不同濃度鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉溶液及不同溫度條件下的穩(wěn)定性，為發(fā)掘生姜作為高附加值產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

生姜購(gòu)自淮安市城南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，將生姜老姜莖塊洗凈后切片，置于干燥箱中60 ℃烘干，粉碎，過40目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自金克?。ㄌ旖颍┥锛夹g(shù)有限公司，亞硝酸鈉購(gòu)自無錫拜爾化工廠，硝酸鋁購(gòu)自上海展云化工有限公司，乙醇購(gòu)自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司，甲醇和乙酸乙酯購(gòu)自揚(yáng)州市華富化工有限公司。主要儀器設(shè)備：UV1801紫外可見分光光度計(jì)[北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司]，DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海亦博實(shí)業(yè)有限公司），0521型索氏提取器（成都喬躍儀器有限公司），DCTE-1000超聲波萃取儀（北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司），HH-600型恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司），F(xiàn)A1004型分析天平（上海卓精電子科技有限公司），JYT-1托盤天平（常熟市桂衡天平儀器有限公司），JYL-C012榨汁機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司），JJ-2型組織搗碎機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將蘆丁置于120 ℃干燥箱中干燥至恒重后，精確稱取0.0200 g置于100 mL容量瓶中，用80%乙醇溶解并定容至刻度，顏色呈淺黃色，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液管分別移取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL配好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，振勻后放置5 min，再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，振勻后放置5 min，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液10.0 mL，用80%乙醇定容至刻度線，蓋上塞子，振勻后放置10 min，用UV1801紫外可見分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光值（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.71504x-0.01861（R2=0.9992）。

1. 2. 2 樣品測(cè)定 稱取5.0 g生姜粉置于錐形瓶中，加入100 mL 80%乙醇，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h，冷卻過濾，取濾液2.5 mL于50 mL容量瓶中，分別加入亞硝酸鈉溶液1.0 mL，振勻，放置5 min，再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，振勻后放置5 min，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液10.0 mL，用80%乙醇定容至刻度線，蓋上塞子，振蕩搖勻后放置10 min，于UV1801紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定吸光值，計(jì)算生姜黃酮含量，再根據(jù)公式計(jì)算黃酮提取率。

提取率（%）=提取生姜黃酮質(zhì)量/生姜粉末質(zhì)

量×100

1. 2. 3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 2. 3. 1 不同提取方法對(duì)生姜黃酮提取率的影響

水浴浸提法：稱取5.0 g生姜粉置于錐形瓶中，放入80%乙醇，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

索氏提取法：稱取5.0 g生姜粉置于圓底燒瓶中，加入80%乙醇100 mL，回流溫度80 ℃，用索氏提取器回流提取1 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

超聲波輔助提取法：稱取5.0 g生姜粉置于超聲波輔助提取儀中，加入80%乙醇100 mL，浸提溫度80 ℃，開啟超聲波儀器，時(shí)長(zhǎng)1 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 3. 2 不同溶劑對(duì)生姜黃酮提取率的影響 分別稱取5.0 g生姜粉末置于4個(gè)錐形瓶中，再分別量取水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯100 mL于錐形瓶中，在80 ℃水浴鍋中浸提3 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 3. 3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)生姜黃酮提取率的影響

分別稱取5.0 g生姜粉末置于5個(gè)錐形瓶中，再分別加入50%、60%、70%、80%和90%的乙醇100 mL于錐形瓶中，在80 ℃水浴鍋中浸提3 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 3. 4 液料比對(duì)生姜黃酮提取率的影響 分別稱取5.0 g生姜粉末置于5個(gè)錐形瓶中，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1放入80%乙醇，在80 ℃水浴鍋中浸提3 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 3. 5 浸提溫度對(duì)生姜黃酮提取率的影響 分別稱取5.0 g生姜粉末置于5個(gè)錐形瓶，放入80%乙醇100 mL，分別在50、60、70、80和90 ℃水浴條件下浸提3 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 3. 6 浸提時(shí)間對(duì)生姜黃酮提取率的影響 分別稱取5.0 g生姜粉末置于5個(gè)錐形瓶，放入80%乙醇100 mL，在80 ℃水浴鍋中分別浸提1、2、3、4和5 h，按照1.2.2步驟中“冷卻過濾”開始操作，計(jì)算生姜黃酮含量。

1. 2. 4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以生姜黃酮提取率為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間4因素為自變量，以-1、0和1分別代表變量的3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化生姜黃酮提取工藝。試驗(yàn)因素與水平見表1。

1. 2. 5 生姜黃酮穩(wěn)定性研究 參考高紅巖（2016）、吳玲（2017）的方法，稍作修改。在最佳工藝條件下進(jìn)行生姜黃酮提取，冷卻過濾后配制成水溶液，分別考察鹽酸（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）、氯化鈉（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）、氫氧化鈉（0.010%、0.015%、0.020%、0.025%和0.030%）和溫度（50、60、70、80和90 ℃）對(duì)生姜黃酮穩(wěn)定性的影響，分析黃酮穩(wěn)定性。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Duncans新復(fù)極差法對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析，Box-Benhnken 8.0對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 不同提取方法對(duì)生姜黃酮提取率的影響

由圖1可知，水浴浸提法獲得的生姜黃酮提取率較索氏提取法和超聲波輔助提取法的提取率稍低，3種方法提取率間差異顯著（P<0.05，下同），以超聲波輔助提取法的提取率較高。但索氏提取時(shí)間久，實(shí)驗(yàn)儀器使用較復(fù)雜且安全性低;超聲波輔助提取法提取率高，細(xì)胞破裂快，相互滲透，可加快溶劑的運(yùn)動(dòng)，但受超聲波衰減因素的制約，超聲有效作用區(qū)域?yàn)橐画h(huán)形，若提取罐的直徑太大，在罐的周壁會(huì)形成超聲空白區(qū)。從節(jié)能和環(huán)保方面考慮，本研究選用水浴浸提法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 1. 2 不同溶劑對(duì)生姜黃酮提取率的影響 由圖2可知，在相同條件下，甲醇的生姜黃酮提取率最高，其次是乙酸乙酯和乙醇，二者的黃酮提取率差異不顯著（P>0.05，下同），但均顯著高于水的黃酮提取率。但甲醇有毒，若使用大量甲醇提取黃酮對(duì)環(huán)境和人類均會(huì)造成不良影響;乙酸乙酯由于脂類含量較高，其提取液渾濁，不清澈;若用水提取，提取率較低，且放置時(shí)間久易霉變。相比之下選用乙醇提取較適宜，污染較小。

2. 1. 3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)生姜黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，生姜黃酮提取率呈先升后降的變化趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，黃酮提取率最高（1.793%），顯著高于其他體積分?jǐn)?shù)的提取率，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的提取率次之，而乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%與90%的提取率差異不顯著。為確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，將乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)為60%、70%和80%。

2. 1. 4 液料比對(duì)生姜黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著液料比的增大，生姜黃酮提取率呈先升后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)液料比達(dá)25∶1時(shí)，黃酮提取率最高（2.021%）。這是因?yàn)槭褂玫囊掖剂吭龆啵腆w物接觸面積增大，但過量的乙醇會(huì)與黃酮發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，結(jié)合生成酚酸類物質(zhì)，造成黃酮含量降低。液料比25∶1與20∶1、30∶1的提取率差異顯著，但液料比20∶1與30∶1的提取率差異不顯著。為確定最佳液料比，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，將液料比設(shè)為20∶1、25∶1和30∶1。

2. 1. 5 浸提溫度對(duì)生姜黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著浸提溫度由50 ℃升至80 ℃，生姜黃酮提取率不斷增加，浸提溫度為80 ℃時(shí)提取率最高，達(dá)2.142%;當(dāng)溫度超過80 ℃后，提取率開始降低，其原因可能是浸提溫度過高破壞生姜中黃酮類物質(zhì)的生物活性。浸提溫度為70和80 ℃時(shí)的提取率差異不顯著，而浸提溫度為80和90 ℃時(shí)的提取率差異顯著。為確定最佳浸提溫度，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，將浸提溫度設(shè)為60、70和80 ℃。

2. 1. 6 浸提時(shí)間對(duì)生姜黃酮提取率的影響 由圖6可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，生姜黃酮提取率逐漸升高，浸提4 h的提取率最高（1.871%），超過4 h后提取率有所降低，但差異不顯著，其原因可能是黃酮在熱效應(yīng)中氧化流失。為確定最佳浸提時(shí)間，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，將浸提時(shí)間設(shè)為3、4和5 h。

2. 2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 模型建立及方差分析結(jié)果 以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（D）4個(gè)因素設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。利用Box-Benhnken 8.0建立的生姜黃酮提取率（Y）對(duì)4個(gè)因素的二次方程模型為：Y=2.10-0.088A-0.10B+0.30C+0.058D-0.15AB-5.25E-003 AC+0.50AD+0.19BC-0.35BD-0.13CD-0.18A2-0.23B2-0.22C2-0.24D2。

通過對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆讲罘治觯ū?）可知，模型的F=13.90和P<0.01，即該模型極顯著。模型失擬項(xiàng)P=0.9988>0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.9329，調(diào)整系數(shù)Adj-R2=0.8658即模型失擬項(xiàng)不顯著，擬合程度好，響應(yīng)值的變化有86.58%源于試驗(yàn)所選影響因素，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，適用于生姜黃酮提取工藝的優(yōu)化。

在回歸模型中，一次項(xiàng)C對(duì)生姜黃酮提取率的影響極顯著（P<0.01，下同），一次項(xiàng)A和B對(duì)生姜黃酮提取率的影響顯著，一次項(xiàng)D對(duì)生姜黃酮提取率的影響不顯著;二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2對(duì)生姜黃酮提取率的影響極顯著。交互項(xiàng)AD和BD對(duì)生姜黃酮提取率的影響極顯著，BC和CD對(duì)生姜黃酮提取率的影響顯著，AB和AC對(duì)生姜黃酮提取率無顯著影響。4個(gè)因素對(duì)生姜黃酮提取率影響的排序?yàn)榻釡囟?液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提時(shí)間。

2. 2. 2 響應(yīng)面分析結(jié)果 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間4因素間的交互作用對(duì)生姜黃酮提取效果影響的響應(yīng)面圖如圖7～圖12所示。圖9和圖11分別顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間、液料比與浸提時(shí)間交互作用對(duì)生姜黃酮提取效果的影響，二者的響應(yīng)面曲線與等高線橢圓弧度較接近;其中圖9的響應(yīng)面曲線最陡，等高線橢圓弧度最大，即乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間的交互效應(yīng)最顯著。圖10和圖12分別顯示液料比與浸提溫度、浸提溫度與浸提時(shí)間交互作用對(duì)生姜黃酮提取效果的影響，二者的響應(yīng)面曲線與等高線橢圓弧度較接近;其中圖10的響應(yīng)面曲線較陡，等高線橢圓弧度較大，即液料比與浸提溫度的交互效應(yīng)較顯著。圖7和圖8分別顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提溫度交互作用對(duì)生姜黃酮提取效果的影響，其響應(yīng)面曲線較平滑，等高線接近圓形，即交互效應(yīng)不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2. 2. 3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 優(yōu)化獲得生姜黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比29.86∶1、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間3 h，在此條件下生姜黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為2.457%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，且在實(shí)際生產(chǎn)中符合操作性，修正工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比30∶1、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間3 h，在此條件下實(shí)際測(cè)得的生姜黃酮提取率為2.396%，與預(yù)測(cè)值基本相符合，其相對(duì)誤差為2.482%，表明模型正確，響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)生姜黃酮提取工藝的優(yōu)化結(jié)果有效，適合生姜黃酮提取工藝優(yōu)化。

2. 3 生姜黃酮穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

研究不同濃度的鹽酸、氯化鈉和氫氧化鈉溶液及不同溫度等條件對(duì)生姜黃酮溶液的影響，分析生姜黃酮穩(wěn)定性，結(jié)果見圖13～圖16。由圖13～圖15可知，生姜黃酮溶液在不同濃度鹽酸和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性較好，基本保持穩(wěn)定趨勢(shì)，說明氯離子和鈉離子對(duì)黃酮的穩(wěn)定性影響較小;生姜黃酮溶液在氫氧化鈉溶液中的穩(wěn)定性較差，隨著氫氧化鈉濃度的增加，其含量呈波動(dòng)降低趨勢(shì)，說明黃酮在堿性環(huán)境中受破壞的程度更大。由圖16可知，在50～80 ℃條件下，溫度對(duì)生姜黃酮的穩(wěn)定性影響較小，當(dāng)溫度達(dá)90 ℃時(shí)，其含量呈降低趨勢(shì)，穩(wěn)定性較差。

3 討論

至今，已有學(xué)者對(duì)生姜不同部位的黃酮提取工藝進(jìn)行研究。王宗成等（2015）以生姜莖葉為研究對(duì)象，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，獲得黃酮提取率為1.54%;高紅巖（2016）以新鮮生姜根莖為研究對(duì)象，利用乙醇提取生姜黃酮，獲得提取率為2.14%;羅思玲等（2019）以生姜?dú)堅(jiān)鼮檠芯繉?duì)象，采用甲醇為提取溶劑，利用響應(yīng)面法優(yōu)化生姜黃酮提取工藝，其提取率為1.04%。本研究利用生姜老姜為研究對(duì)象，以乙醇為提取劑，獲得生姜黃酮提取率為2.396%，一定程度上提高了生姜老姜黃酮提取率，且污染程度較甲醇提取劑低。

目前較多的研究采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化生姜黃酮提取工藝（郭艷華等，2010;許慶陵等，2012;吳玲，2017;孫曉玲，2018），但正交設(shè)計(jì)無法確定試驗(yàn)影響因素的最佳組合和試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)值的最大值。響應(yīng)面設(shè)計(jì)可提供試驗(yàn)因素的交互作用，具有試驗(yàn)精度較高的特點(diǎn)（侯銀臣等，2019;張寬朝等，2019）。本研究通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化乙醇浸提生姜老姜黃酮的工藝，建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)因素對(duì)生姜黃酮提取率的二次方程模型：Y=2.10-0.088A-0.10B+0.30C+0.058D-0.15AB-5.25E-003AC+0.50AD+0.19BC-0.35BD-0.13CD-0.18A2-0.23B2-0.22C2-0.24D2。通過方差分析，該模型擬合程度好，適用于生姜黃酮提取工藝的優(yōu)化;通過顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，4個(gè)因素對(duì)生姜黃酮提取率影響的排序?yàn)榻釡囟?液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提時(shí)間。通過響應(yīng)面分析因素間的交互作用，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間的交互作用、液料比與浸提時(shí)間的交互作用極顯著，與高淑云和葛壯壯（2012）的研究結(jié)果一致，與王宗成等（2015）的研究結(jié)果不一致，可能與采用的試驗(yàn)方法、生姜品種不同有關(guān)。

生姜黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，生姜黃酮溶液在不同濃度鹽酸和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性較好，基本保持穩(wěn)定趨勢(shì)，在氫氧化鈉溶液中的穩(wěn)定性較差，隨著氫氧化鈉濃度的增加，其含量呈降低趨勢(shì)。在50～80 ℃條件下，溫度對(duì)生姜黃酮的穩(wěn)定性影響不大，當(dāng)溫度達(dá)90 ℃時(shí)，其含量呈降低趨勢(shì)，穩(wěn)定性較差。這主要是由于黃酮是一種熱敏感物質(zhì)，較高的溫度會(huì)降解化合物中生物活性成分，因此在使用和儲(chǔ)藏中應(yīng)盡量避免高溫環(huán)境條件。本研究在穩(wěn)定性評(píng)價(jià)中選擇酸性、堿性、中性溶液和溫度等因素，其結(jié)果具有一定的系統(tǒng)性和科學(xué)性，可為生姜資源的深度開發(fā)提供研究依據(jù)。但本研究未能確定起穩(wěn)定性的具體成分，因此確定其生物活性成分和開展藥物動(dòng)力學(xué)研究將是今后的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化的生姜黃酮乙醇浸提工藝所需設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作、提取溫度較低、污染小、耗能低且提取率較高，可用于生姜黃酮規(guī)?；崛。瑫r(shí)生姜黃酮可作為天然穩(wěn)定劑進(jìn)行開發(fā)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）

收稿日期：2020-04-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-JS-28）;科技部重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2013ZX09402203）;江蘇高?！扒嗨{(lán)工程”項(xiàng)目（2017）;淮安市“ 533”英才工程項(xiàng)目（2017）

作者簡(jiǎn)介：吳存兵（1980-），副教授，主要從事生物學(xué)及食品加工與分析工作，E-mail：wucunbingw@163.com