胡珊珊 陳開(kāi)莉 陳紅賢 鄔開(kāi)鑫 尤忠毓

摘要：為了開(kāi)發(fā)新型昆蟲(chóng)抗菌肽資源，以黑水虻幼蟲(chóng)為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)從黑水虻幼蟲(chóng)總RNA中擴(kuò)增到一個(gè)新型抗菌肽基因DLP-5，并利用在線(xiàn)生物軟件和工具分析了抗菌肽DLP-5的生物信息學(xué)特征。結(jié)果表明，DLP-5由40個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為4 226.83 u，等電點(diǎn)為7.87，具有兩親性特征，其中N端為疏水性，C端為親水性，具有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，無(wú)糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)。DLP-5的三級(jí)結(jié)構(gòu)包含1個(gè)N端的loop區(qū)、1個(gè)α螺旋和1對(duì)反向平行β折疊，構(gòu)成了防御素類(lèi)抗菌肽典型的“環(huán)-螺旋-折疊”結(jié)構(gòu)，說(shuō)明DLP-5是一個(gè)新型的防御素類(lèi)抗菌肽，可通過(guò)與微生物膜相互作用發(fā)揮其抗菌活性。

關(guān)鍵詞：昆蟲(chóng)抗菌肽;黑水虻;基因克隆;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0049-04

昆蟲(chóng)抗菌肽是昆蟲(chóng)受到刺激或感染后由體內(nèi)血淋巴產(chǎn)生的一類(lèi)小分子堿性多肽，經(jīng)體內(nèi)和體外的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，它具有廣譜抗菌活性、分子量小、容易合成、不易形成耐藥性等特性，可作為傳統(tǒng)抗生素的潛在替代抗菌制劑[1-2]。黑水虻（Hermitia illucens L.）是雙翅目水虻科扁角水虻屬的一種資源昆蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)以動(dòng)物糞便、腐爛的有機(jī)物及植物性垃圾為食，在禽畜糞便及餐廚垃圾的無(wú)害化處理中應(yīng)用前景廣闊[3]。夏嬙等利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽，該抗菌肽可以有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，黑水虻抗菌肽具有很好的熱穩(wěn)定性、反復(fù)凍融性[4-5]。Park等利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)從黑水虻幼蟲(chóng)的cDNA中成功克隆了抗菌肽編碼基因DLP1-DLP4[6];Li等在畢赤酵母中重組表達(dá)了黑水虻抗菌肽DLP2和DLP4，活性研究表明DLP2和DLP4具有較強(qiáng)的抗菌性能，特別是對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有快速的殺滅活性，其最小殺菌濃度（MIC）為0.01 μmol/L[7]。Elhag等從黑水虻幼蟲(chóng)的cDNA中篩選到了7種抗菌肽基因[cecropinZ1、sarcotoxin1、sarcotoxin（2a）、sarcotoxin（2b）、sarcotoxin3、stomoxynZH1和stomoxynZH1（a）]，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了stomoxynZH1，活性研究表明，重組stomoxynZH1對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcu saureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）均具有較高的抗菌活性[8]。由此可見(jiàn)，黑水虻及其幼蟲(chóng)體內(nèi)含有豐富的內(nèi)源性抗菌肽，本試驗(yàn)旨在克隆新型黑水虻抗菌肽，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黑水虻抗菌肽資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Taq Plus DNA Polymerase、柱式動(dòng)物總RNA抽提純化試劑盒、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞和克隆載體pUCm-T購(gòu)買(mǎi)于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆 根據(jù)已報(bào)道的黑水虻抗菌肽編碼序列[6]，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物HIP-1：5′-GCMACCTGTGAYCTSTTGAGYCC-3′，HIP-2：5′-DYKYCKGCARTTRCAAACRGCTC-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合菌液誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽[5]，采用柱式動(dòng)物總RNA抽提純化試劑盒提取其幼蟲(chóng)的總RNA。以總RNA為模板，采用一步RT-PCR擴(kuò)增試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并直接擴(kuò)增出目的片段，反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明。反應(yīng)條件：45 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保持。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，采用DNA膠回收試劑盒回收目的基因。將膠回收得到的目的片段與pUCm-T進(jìn)行連接，連接體系：連接緩沖液1 μL;膠回收產(chǎn)物 7 μL;T4 DNA連接酶1 μL;pUCm-T 1 μL?；旌暇鶆蚝?6 ℃恒溫連接16 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，利用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.2.2 黑水虻抗菌肽基因的生物信息學(xué)分析 利用軟件DNAman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，查找開(kāi)放閱讀框;利用NCBI-Blast在線(xiàn)工具對(duì)氨基酸序列的相似性進(jìn)行比對(duì);利用ProtParam在線(xiàn)工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)抗菌肽的氨基酸理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析抗菌肽的跨膜結(jié)構(gòu);利用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析抗菌肽的信號(hào)肽;利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)抗菌肽的疏水性進(jìn)行分析;利用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析抗菌肽的磷酸化位點(diǎn);利用NetOGlyc 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分析抗菌肽的糖基化位點(diǎn);利用SWISS-MODEL在線(xiàn)服務(wù)（http：//www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，構(gòu)建抗菌肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑水虻抗菌肽基因的克隆

以菌液浸泡后的黑水虻幼蟲(chóng)為原料，提取總RNA，利用HIP-1和HIP-2為引物進(jìn)行一步 RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在120bp左右有特異性條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物膠回收純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化于E. coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選9個(gè)重組子進(jìn)行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果獲得的多肽序列與已知的黑水虻抗菌肽序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示，其中3條序列與文獻(xiàn)報(bào)道的黑水虻抗菌肽（DLP-3）序列相同[6]，另有1條的序列與報(bào)道序列存在多個(gè)氨基酸的差異，將其命名為DLP-5，經(jīng)NCBI-Blast在線(xiàn)工具比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)與DLP-5完全相同的序列，因此，DLP-5為新抗菌肽序列。

2.2 抗菌肽DLP-5的理化性質(zhì)

利用ProtParam在線(xiàn)工具對(duì)抗菌肽DLP-5的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表1。DLP-5由40個(gè)氨基酸殘基組成，其分子式為C173H278N58O54S6，分子量4 226.83 u，等電點(diǎn)7.87。經(jīng)預(yù)測(cè)，DLP-5在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期為4.4 h，在酵母菌和大腸桿菌中的半衰期均大于10 h。DLP-5的親水性平均系數(shù)為-0.068，說(shuō)明其為親水性蛋白。

2.3 抗菌肽DLP-5的跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析

利用TMHMM Server v. 2.0和SignalP 5.0對(duì)抗菌肽DLP-5的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽進(jìn)行分析。結(jié)果表明，DLP-5沒(méi)有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，因此，抗菌肽DLP-5很可能是位于細(xì)胞質(zhì)中的胞漿蛋白。

2.4 抗菌肽DLP-5的疏水性分析

利用ProtScale工具對(duì)抗菌肽DLP-5的疏水性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示，正值為疏水，負(fù)值為親水，因此，抗菌肽DLP-5明顯具有兩親性特征，其N(xiāo)端具有疏水性，C端具有親水性。結(jié)合親水性平均系數(shù)，DLP-5的總體親水性大于疏水性。

2.5 抗菌肽DLP-5的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后常見(jiàn)的加工方式，對(duì)蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮具有重要影響。利用NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0分別對(duì)抗菌肽DLP-5的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在DLP-5分子內(nèi)沒(méi)有糖基化位點(diǎn)，但存在3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸（圖4）。

2.6 抗菌肽DLP-5的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SWISS-MODEL在線(xiàn)服務(wù)對(duì)抗菌肽 DLP-5 的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源建模，構(gòu)建其結(jié)構(gòu)模型，如圖5所示。模型顯示DLP-5包含1個(gè)N端的loop區(qū)、1個(gè)α螺旋和1對(duì)反向平行β折疊，三者構(gòu)成了一個(gè)典型的“環(huán)-螺旋-折疊”結(jié)構(gòu)。

3 討論

昆蟲(chóng)抗菌肽因具有抗菌活性高、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[9]。為了開(kāi)發(fā)新型的昆蟲(chóng)抗菌肽，本試驗(yàn)以黑水虻幼蟲(chóng)為原料，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從幼蟲(chóng)總RNA中擴(kuò)增得到一條抗菌肽編碼基因，該基因所編碼的多肽DLP-5包含40個(gè)氨基酸殘基，與文獻(xiàn)報(bào)道的 DLP-1、DLP-2、DLP-3、DLP-4具有較高的同源性[6]。

在獲得DLP-5的氨基酸序列基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。通過(guò)理化性質(zhì)分析表明，DLP-5屬于帶正電荷的陽(yáng)離子型抗菌肽，該類(lèi)抗菌肽通?？勺饔糜趲ж?fù)電荷的微生物膜，通過(guò)桶板模型、毯式模型、超環(huán)面模型等方式發(fā)揮抗菌作用[10]。此外，在氨基酸組成上，DLP-5含有5個(gè)甘氨酸殘基，而富含甘氨酸的抗菌肽大多對(duì)革蘭氏陰性菌有著較高的抑菌活性[9]。因此，DLP-5 可能更容易抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)。

抗菌肽的疏水性對(duì)其抑菌活性有較大影響，適當(dāng)提高其疏水性，可增強(qiáng)抗菌活性[11]。對(duì)DLP-5的疏水性分析表明，DLP-5具有明顯的兩親性特征，其N(xiāo)端的疏水性強(qiáng)，有利于DLP-5與微生物膜的結(jié)合，C端的親水性強(qiáng)，有利于DLP-5在水溶液中的溶解性。雖然兩親性結(jié)構(gòu)有利用抗菌肽的抗菌活性，但需要注意的是完全的兩親性結(jié)構(gòu)在提高抗菌活性的同時(shí)，也增加了抗菌肽的細(xì)胞毒性。

蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLP-5存在3個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)（第2位的蘇氨酸、第7位的絲氨酸和第21位的絲氨酸），這些位點(diǎn)可為其表面修飾的發(fā)生提供可能，而實(shí)際的磷酸化情況還需進(jìn)行更深入的研究。

抗菌肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其抑菌活性也有重要影響。本試驗(yàn)通過(guò)同源建模的方式構(gòu)建了DLP-5的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示DLP-5顯現(xiàn)出一種“環(huán)-螺旋-折疊”的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)特征與大多數(shù)昆蟲(chóng)防御素的結(jié)構(gòu)相似，都具有N端loop、單個(gè)α-螺旋和2個(gè)反平行的-β折疊結(jié)構(gòu)域[12]。因此，DLP-5可能屬于昆蟲(chóng)防御素類(lèi)抗菌肽家族。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)從黑水虻幼蟲(chóng)中克隆了一種新型抗菌肽DLP-5，利用相關(guān)生物軟件及在線(xiàn)工具分析了DLP-5的生物信息學(xué)特征，為后續(xù)DLP-5的基因工程制備奠定了理論基礎(chǔ)，也為深入理解DLP-5的作用機(jī)制提供了理論參考。

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