孟軻音，萬忠海，李吉平，卜昭陽，繆發(fā)明，姚騰，高玉偉，劉軍

軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122

新型冠狀病毒?。–OVID-19）是繼2003年SARS、2004年禽流感、2014年埃博拉疫情以來的又一起國際公共衛(wèi)生事件，目前全球感染人數(shù)不斷攀升，國際疫情仍未得到有效控制，人類生命健康受到嚴(yán)重威脅，也給社會經(jīng)濟造成重大損失。故此，相關(guān)機構(gòu)陸續(xù)開展了新型冠狀病毒檢測、疫苗研制、防治藥物篩選及致病機制研究工作。我國衛(wèi)健委按其危害程度，將SARS-CoV-2歸為二類病原微生物進行管理，規(guī)定動物感染實驗應(yīng)當(dāng)在動物生物安全三級實驗室操作[1]。本文結(jié)合生物安全實驗室管理相關(guān)法律法規(guī)及實際工作經(jīng)驗，以SARS-CoV-2感染獼猴為例，對風(fēng)險評估、實驗室類型及關(guān)鍵防護設(shè)備、人員培訓(xùn)、個體防護裝備、人員進出流程、獼猴轉(zhuǎn)運、獼猴實驗操作、消毒滅菌、意外事故處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的生物安全有關(guān)事項進行闡述。

1 新型冠狀病毒感染獼猴實驗風(fēng)險評估

1.1 風(fēng)險評估時機及方式

在開展新冠病毒獼猴感染實驗前，應(yīng)進行相關(guān)實驗活動風(fēng)險評估，識別風(fēng)險因素，建立風(fēng)險控制措施，評估風(fēng)險級別。

本實驗的風(fēng)險評估由實驗人員與生物安全管理人員共同完成。實驗人員主要側(cè)重生物因子和實驗活動的風(fēng)險分析，生物安全管理團隊依據(jù)生物因子特性及擬開展的實驗活動負(fù)責(zé)設(shè)施設(shè)備、個體防護裝備、人員進出、消毒滅菌、意外事故等的風(fēng)險分析。

1.2 風(fēng)險評估側(cè)重點

SARS-CoV-2可感染人和其他哺乳動物，除經(jīng)飛沫和密切接觸傳播外，也有通過氣溶膠、糞-口及眼結(jié)膜多種途徑傳播的可能。其傳染性強、傳播速度快[2]，加之本次實驗動物為獼猴，較對鼠的生物安全管理復(fù)雜很多。因此，我們在充分考慮此病原特性及實驗動物特點的基礎(chǔ)上，著重在動物飼養(yǎng)操作籠具的設(shè)計、個體防護裝備的選用、動物逃逸風(fēng)險的分析方面進行反復(fù)研討，多次論證。

2 實驗室類型及關(guān)鍵防護設(shè)備

2.1 實驗室類型

根據(jù)實驗室設(shè)施條件和動物飼養(yǎng)設(shè)備不同，ABSL-3分為不同類型，具備開展新冠病毒獼猴感染實驗的ABSL-3實驗室包括《實驗室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）規(guī)定的4.4.2和4.4.3類實驗室，主要區(qū)別是是否可有效利用安全隔離裝置（如生物安全柜、手套箱式隔離器）操作常規(guī)量經(jīng)空氣傳播致病性生物因子。目前在生物安全實驗室使用的猴飼養(yǎng)隔離器主要有2類，一類是半開放式隔離器，另一類是全封閉的手套箱式隔離器。如果采用前者飼養(yǎng)動物，須在4.4.3類實驗室工作；如果采用后者飼養(yǎng)動物，則在4.4.2類實驗室即可。本實驗室采用手套箱式負(fù)壓隔離器，隔離器符合《實驗室設(shè)備生物安全性能評價技術(shù)規(guī)范》（RB/T 199-2015）的要求，因此使用4.4.2類實驗室開展獼猴感染實驗。

2.2 關(guān)鍵防護設(shè)備

開展本實驗涉及的關(guān)鍵防護設(shè)備，如生物安全柜、雙扉高壓滅菌器、過氧化氫發(fā)生器均為標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備，而獼猴負(fù)壓隔離裝置目前缺乏像鼠IVC籠具一樣的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備。依據(jù)獼猴智力發(fā)達(dá)、攻擊性強、喜抓咬等特點，為了確保獼猴飼養(yǎng)和實驗操作的安全性，我們從以下幾方面考慮，設(shè)計制作了手套箱式獼猴負(fù)壓隔離器：①負(fù)壓隔離器在氣密性及相對壓差應(yīng)符合《實驗室設(shè)備生物安全性能評價技術(shù)規(guī)范》（RB/T 199-2015）的要求；②負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有傳遞窗，以便獼猴及物品的相互傳遞；③負(fù)壓隔離器上應(yīng)安裝獼猴保定用人工推拉式拉桿，以盡可能避免實驗過程中獼猴對人員造成傷害；④負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有備用風(fēng)機，以避免負(fù)壓隔離器故障帶來生物安全風(fēng)險；⑤負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有鎖具。

3 培訓(xùn)考核

擬進本實驗室開展工作的實驗人員，均須經(jīng)過實驗室培訓(xùn)并考核合格。

3.1 人員培訓(xùn)

本實驗室將人員培訓(xùn)分為4個等級。一級主要為生物安全通用環(huán)節(jié)培訓(xùn)，包括生物安全基本知識、人員進出流程、個體防護裝備穿脫、廢棄物處理、高壓滅菌、實驗室日常清理及消毒、設(shè)施設(shè)備操作等；二級在一級培訓(xùn)的基礎(chǔ)上增加了細(xì)胞實驗生物安全操作；三級在二級培訓(xùn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上增加小鼠實驗生物安全操作；四級在以上三級培訓(xùn)內(nèi)容外，根據(jù)工作實際需要增加了大中動物（如猴、貂、狗、貓、豬等）生物安全操作。

3.2 人員考核

實驗人員經(jīng)過培訓(xùn)后均須接受專家組的考核，考核合格后可獲得實驗室相應(yīng)等級證書，并且實驗室為每一名實驗人員單獨建立了人員技術(shù)檔案和培訓(xùn)檔案。獲得一級證書的人員可作為實驗實習(xí)員進入實驗室，不得獨立開展實驗；獲得二級及以上證書的人員為實驗正式人員，可根據(jù)等級證書培訓(xùn)范圍開展相應(yīng)實驗。

獲得四級證書的人員方可開展SARS-CoV-2感染獼猴實驗。且由于新冠病毒是一種新的病毒，對其了解不充分，因此開展相關(guān)動物實驗可能會遇到新的問題。本實驗室在實驗開始前和實驗過程中，除了開展常規(guī)的生物安全培訓(xùn)外，還多次組織實驗室管理人員和項目人員集中學(xué)習(xí)研討，及時發(fā)現(xiàn)并解決實驗過程中存在的問題，改進優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），建立了非常良好的工作交流機制，為開展新冠病毒獼猴感染實驗提供了人員技術(shù)保障。

4 個體防護裝備

4.1 個體防護裝備的選用

在ABSL-3實驗室開展實驗時，通常個體防護裝備選用雙層防護服配雙層鞋套，其中內(nèi)層為棉質(zhì)面料，外層為一次性防護面料，另外還須佩戴雙層手套、護目鏡和N95口罩。

在SARS-CoV-2感染獼猴實驗中，由于SARS-CoV-2傳染性極強、傳播速度極快等特點，建議面部防護選用正壓頭罩內(nèi)戴N95口罩替代護目鏡。對獼猴進行麻醉、免疫、攻毒、采樣、解剖實驗時，還應(yīng)根據(jù)具體情況佩戴防抓咬手套和防割傷手套，用X線對獼猴進行影像檢查時還應(yīng)穿戴防輻射隔離衣。另外，用雙扉高壓滅菌器進行實驗廢棄物消毒滅菌時還應(yīng)佩戴防燙傷手套。

4.2 選用時注意事項

應(yīng)根據(jù)個人身材特點選擇合適尺碼的防護服，以增加實驗操作的舒適性，減少暴露風(fēng)險。一次性防護服標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合歐標(biāo)EN14126，如需無菌操作，還應(yīng)符合GB 19082-2012[3-4]。

雙層手套建議選用內(nèi)深外淺的乳膠或丁腈手套，以便在手套破損時容易識別。實驗過程中如外層手套被污染，應(yīng)及時更換。

5 人員進出流程

5.1 一般流程

實驗室人員應(yīng)遵循潔凈區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)的進入原則，退出應(yīng)遵循污染區(qū)、半污染區(qū)、潔凈區(qū)的退出原則。通常將更換潔凈衣物的更衣室劃為潔凈區(qū)，更換防護服的更衣室、緩沖間和緩沖走廊劃為半污染區(qū)、核心間劃為污染區(qū)[5]。

5.2 特殊流程

在SARS-CoV-2感染獼猴實驗中，實驗人員往往在動物實驗后還要進行細(xì)胞實驗，須從一個核心區(qū)轉(zhuǎn)移到另一個核心區(qū)。轉(zhuǎn)移過程中，實驗人員應(yīng)在與核心間相鄰的緩沖間脫掉外層防護服，在緩沖走廊換上預(yù)先準(zhǔn)備好的一次性防護服，既而進入下一個核心間。

6 獼猴轉(zhuǎn)運

6.1 轉(zhuǎn)運包裝物的選擇

獼猴轉(zhuǎn)運時最好選用一次性包裝物，通常采用特制的轉(zhuǎn)運籠或雙層生物安全包裝。轉(zhuǎn)運包裝物不得隨意帶出，必須經(jīng)雙扉高壓滅菌器高壓后方可轉(zhuǎn)出實驗室。

6.2 轉(zhuǎn)運路線

在用獼猴開展SARS-CoV-2研究工作時，須將待養(yǎng)在觀察區(qū)的獼猴轉(zhuǎn)運至ABSL-3實驗室核心區(qū)負(fù)壓籠具內(nèi)。根據(jù)獼猴體型特點，一般可從傳遞窗傳入。由于獼猴動作敏捷、攻擊力較強，故傳入前應(yīng)先將獼猴麻醉，后經(jīng)輔助區(qū)傳遞窗傳至緩沖走廊，再經(jīng)緩沖走廊傳遞窗傳至核心區(qū)。

6.3 轉(zhuǎn)運方法

6.3.1 轉(zhuǎn)運人員布局 獼猴轉(zhuǎn)運時應(yīng)在輔助區(qū)、緩沖走廊、核心間即潔凈區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)分別布設(shè)人員，人員不可逆行，待動物轉(zhuǎn)運完畢后，潔凈區(qū)、半污染區(qū)人員方可按流程進入核心區(qū)。

6.3.2 傳遞窗的使用 用預(yù)先準(zhǔn)備的75%酒精噴灑傳遞窗周圍，以阻斷傳遞窗內(nèi)可能溢出的病毒粒子，然后打開傳遞窗，將帶有外包裝的已麻醉的獼猴放入傳遞窗后關(guān)閉傳遞窗，接著打開另外一側(cè)傳遞窗，開啟前仍須用75%酒精噴灑傳遞窗周圍，開啟后用75%酒精噴灑傳遞窗內(nèi)部，待取出獼猴后關(guān)閉傳遞窗，同時開啟紫外燈照射半小時，再傳遞下一批實驗動物。

7 獼猴實驗操作

7.1 實驗內(nèi)容

在動物生物安全三級實驗室進行操作的新型冠狀病毒獼猴實驗一般包括獼猴麻醉、病毒接種、采血及分離血清、體溫測量、鼻咽肛拭子采樣、病理解剖等。

7.2 注意事項

①實驗操作須2～3名人員進行；②實驗操作均須在獼猴麻醉狀態(tài)下進行；③獼猴麻醉應(yīng)在負(fù)壓動物飼養(yǎng)箱中進行；④實驗操作過程中始終要觀察獼猴是否有蘇醒跡象，如有蘇醒跡象則對獼猴進行追加麻醉；⑤麻醉用注射器應(yīng)裝入盛有消毒劑的銳器盒內(nèi)消毒，而后裝入雙層生物安全包裝袋內(nèi)雙扉高壓處理；⑥采血收集管應(yīng)為螺口離心管，將血液從注射器推入時，管口應(yīng)有酒精棉球覆蓋；⑦進行獼猴氣管內(nèi)接種病毒，注射器在注入及拔出時均須通過酒精棉球；⑧注射器針頭的夾取均須用止血鉗；⑨獼猴尸體的解剖須將尸體按轉(zhuǎn)運規(guī)程運至負(fù)壓解剖箱中進行；⑩實驗用過的耗材均須放在雙層高壓滅菌袋內(nèi)或放入盛有消毒液的高壓滅菌桶內(nèi)浸泡后雙扉高壓處理。

8 消毒滅菌

根據(jù)國家衛(wèi)健委COVID-19相關(guān)指南，酒精、含氯消毒劑、二氧化氯、過氧化氫、過氧乙酸對SARS-CoV-2有較好的殺滅作用，而氯己定對SARS-CoV-2 無效[6-7]。

綜合衛(wèi)健委指南、同行推薦及本實驗室消毒劑效果驗證，從消毒劑的消毒效果、對物品的腐蝕性、對人體的危害程度等多方考量，建議正壓頭罩和主機外表面選用75%酒精噴灑消毒，外層防護服及實驗室日常消毒選用1%衛(wèi)可噴灑消毒，生物安全柜日常消毒選用75%酒精噴灑擦拭消毒，需要浸泡消毒的物品采用75%酒精浸泡消毒，如有被血漬污染的的器械可先用新潔爾滅浸泡去污漬，獼猴尸體及其他廢棄物均須雙層包裝、表面消毒后雙扉高壓處理，實驗室終末消毒采用過氧化氫汽化消毒。

9 意外事故處理

實驗室意外事故有多種類型，本實驗室針對人員意外傷害、感染性物質(zhì)濺灑、儀器設(shè)備故障、動物逃逸、火災(zāi)及自然災(zāi)害等意外事故，均制備了完善的意外事故處置預(yù)案。下面僅就與此實驗特性相關(guān)的意外事故處理加以簡單描述。

9.1 獼猴抓咬傷

獼猴天性好動、抓咬能力強，在實驗過程中一定要避免此類現(xiàn)象的發(fā)生。如意外發(fā)生獼猴抓咬傷，應(yīng)立即停止工作，在同事配合下按程序消毒傷口退出實驗室，到醫(yī)學(xué)觀察室隔離觀察，觀察自覺癥狀，定期檢測核酸。如懷疑有感染癥狀，應(yīng)立即到定點醫(yī)院就醫(yī)，如無自覺癥狀，定期核酸檢測均為陰性，2周后可解除隔離。同時，報告生物安全負(fù)責(zé)人，填寫《意外事故處理記錄》。

9.2 獼猴逃逸

因為獼猴處于清醒狀態(tài)時始終被鎖于負(fù)壓隔離器內(nèi)，故發(fā)生逃逸的可能性極小。ABSL-3實驗室門處于互鎖狀態(tài)，即使獼猴發(fā)生逃逸，也不會逃出實驗室。但為了避免意外發(fā)生，實驗室內(nèi)應(yīng)備有專業(yè)麻醉槍，一旦發(fā)生獼猴逃逸，可利用麻醉槍對其抓捕。

面對國際頻發(fā)的公共衛(wèi)生事件、日趨復(fù)雜的生物安全問題，我國大力加強高等級生物安全實驗室建設(shè)力度，有效提高了突發(fā)疫情的應(yīng)對能力和處置能力，但仍須在更高層次統(tǒng)籌生物安全管理，總結(jié)國內(nèi)外管理方法的差距，健全國家生物安全管理體系，建立國產(chǎn)化防護裝備和產(chǎn)品的各類標(biāo)準(zhǔn)。