郭鶴寶 王星 何山文 張曉霞

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬于芽孢菌屬，該菌株在自然界中的分布中極其廣泛，例如土壤、秸稈、植物根際、甚至湖泊污水中均可分離得到。解淀粉芽孢桿菌形態(tài)、培養(yǎng)特征以及生理生化、16S rRNA基因等方面均與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）等極其相似，常規(guī)鑒定方法難以確定相關(guān)類群的分類地位。隨著鑒定檢測技術(shù)的發(fā)展，持家基因如gyrA、gyrB、rpoB等片段［1］分析以及全基因組測序等方法應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌及其相近種類的比較鑒定［2-3］。

2008年Wang等［4］通過DNA-DNA的相關(guān)性分析得出貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）是解淀粉芽孢桿菌的同物異名（B. amyloliquefaciens）。2016年Dunlap等［5］通過對“B. oryzicola”的基因組進行測序后發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌并不是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，經(jīng)過基因組比較分析顯示甲基營養(yǎng)芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、解淀粉芽孢桿菌植物亞種和貝萊斯芽孢桿菌的基因組僅有微小差異，模式菌株間DNA-DNA雜交值均大于84%，遠高于標準物種閾值70%。因此，將甲基營養(yǎng)芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌植物亞種FZB42應(yīng)重新歸類于貝萊斯芽孢桿菌的類群中。

另外，解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌相關(guān)類群具有廣泛的生物學功能，該類群具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，其分泌的抗生素以及抗菌蛋白等物質(zhì)有抑制細菌和真菌的能力［6］，可以起到較好的生物防治效果；還能作為一種天然的防腐劑，并將其應(yīng)用于各種食品行業(yè)當中，可以抑制腐敗真菌和致病菌的生長［7］。此外，該類群還發(fā)現(xiàn)能夠消除殘留的化學農(nóng)藥［8］、作為動物的益生菌等功能［9］。據(jù)“中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）”數(shù)據(jù)庫顯示，該菌株ACCC 19742對茄子灰霉病、黃瓜枯萎病的病原菌有一定的抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物還可以促進作物根系的生長，可用于制備微生物肥料和生物有機肥等。

中國農(nóng)業(yè)微生物菌種中心庫藏菌株ACCC 19742是2014年從山東蔬菜大棚的土壤中分離并保藏，在ACCC數(shù)據(jù)庫中分類地位為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。在菌種中心定期轉(zhuǎn)接保藏過程中，發(fā)現(xiàn)該菌株在同一培養(yǎng)基上出現(xiàn)兩種不同的菌落形態(tài)，兩株菌的16S rRNA基因相似性為100%，因此推測為同一株菌的不同形態(tài)變異型。經(jīng)16S rRNA基因和基因組比較，并結(jié)合API 20NE、BIOLOG及脂肪酸組成等表型特征分析，確定該菌株的分類地位，并確定不同形態(tài)菌落的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 供試菌株：解淀粉芽孢桿菌ACCC 19742-1和ACCC 19742-2來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。培養(yǎng)基：BUG合成培養(yǎng)基（Biolog，Inc.）；TSA 合成培養(yǎng)基（DifcoTM）［10］；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；R2A 瓊脂培養(yǎng)基（DifcoTM），配方見參照文獻［10］。

1.1.2 主要試劑及儀器 API20 NE試驗條及相關(guān)試劑耗材購自生物梅里埃公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；革蘭氏染料試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 革蘭氏染色法 分別在R2A、TSA、BUG、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種19742-1和19742-2菌株，30℃培養(yǎng)過夜后觀察菌落形態(tài)；菌體使用革蘭氏染色試劑盒法進行染色，參照文獻［11］。

1.2.2 脂肪酸分析法 具體方法參照Ichihara K等［12］文獻。

1.2.3 BIOLOG GEN-Ⅲ微孔板檢測 將19742-1和19742-2菌株在BUG培養(yǎng)基上劃線接種，30℃過夜培養(yǎng)；按照要求將菌液濁度調(diào)到90%后混勻，制成接種液；使用排槍將菌懸液按每孔100 μL的量加入到Gen-III微孔板的96孔內(nèi)；適溫培養(yǎng)4-6 h，12-24 h后通過BIOLOG鑒定系統(tǒng)（Microlog-M，MicroStation，Omnilog?）中的軟件讀取 Gen-III微孔板上所表現(xiàn)出的表型圖譜來對細菌進行鑒定。

1.2.4 API 20NE試劑條法 首先在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種19742-1和19742-2菌株，30℃培養(yǎng)過夜，使用無菌棉簽挑取單菌落，逐量加入滅菌的0.85%生理鹽水，使用比濁管調(diào)節(jié)菌懸液的濁度為0.5麥氏單位。按說明書接種，30℃培養(yǎng)24 h，參考說明表判讀最終結(jié)果。

1.2.5 16S rRNA及持家基因gyrB擴增與分析 （1）DNA提?。喊凑毡本┨旄毦蚪MDNA試劑盒中的說明書提??；通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）；PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻中［10］方法。（2）持家基因gyrB提?。哼\用試劑盒法提取總基因組DNA獲得模板；上游引物（5'-GA AGTCATCATGATGACCGTTCTGCA-3'）、 下 游 引 物（5'-AGCAGGGTACGGATG TGCGAGCC-3'）；PCR 擴增體系和反應(yīng)條件見參考文獻［13］。將擴增完成的目的片段送往上海生工公司進行測序，序列結(jié)果在Ezbiocloud網(wǎng)站上（www.ezbiocloud.net/eztaxon）進行比對，整理后的序列最后用Mega 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.6 19742-1和19742-2菌株基因組拼接與注釋 （1）基因組拼接：基因組DNA提取按照北京天根細菌基因組DNA試劑盒說明書進行，純度和濃度符合測序標準后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行基因組框架圖測定。采用 FastQC（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）首先對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制；使用AdapterRemoval（ver.2.1.7）［14］將低質(zhì)量的reads和污染的接頭去除；采用A5-miseq v2015052［14］軟件對去除接頭序列的測序數(shù)據(jù)進行從頭拼裝，構(gòu)建contigs和scaffolds。（2）基因組預測與注釋 ：通過 KEGG［15］（https：//www.kegg.jp/）、GO 注 釋［16］（http ：//www.geneontology.org/）以及使用在線軟件 tRNAscan-SE 1.21［17］和RNAmmer 1.2［18］對tRNA及rRNA操縱子等進行預測和注釋。

1.2.7 ANI和DDH值分析 使用JSpeciesWS軟件［19］計算ANI值，網(wǎng)站（http：//ggdc.dsmz.de/ggdc.php）得到菌株的DDH值，并上傳菌株相應(yīng)的fasta或fna文件后進行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)比較分析

分別在R2A、BUG、TSA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)進行3次劃線培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)19742-1和19742-2的菌落形態(tài)存在一定差別。如表1匯總所示。

圖1 19742-1（左）和 19742-2（右）菌落形態(tài)

表1 19742-1和19742-2菌落結(jié)構(gòu)特征

2.2 BIOLOG碳源利用和API 20NE試劑條分析

BIOLOG碳源利用：通過實驗得知19742-1能利用25種碳源，19742-2能利用20種碳源，其中有17種碳源被兩種菌共同利用。對于α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、1%乳酸鈉、D-山梨醇、D-甘露醇、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸等反應(yīng)兩者均呈陽性；對于 D-松二糖、水蘇糖、α-D-乳糖、N-Acetyl-β-D甘露糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、肌苷、D-阿拉伯醇、D-阿拉伯醇等反應(yīng)兩者均呈陰性。不同的是，葡聚糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、β-Methyl-D葡萄糖苷、果膠和L-乳酸這8個反應(yīng)中，19742-1菌株呈陽性，而19742-2則呈陰性；明膠、L-精氨酸和L-組氨酸這3個反應(yīng)中，19742-2菌株呈陽性或弱陽性，而19742-1呈陰性。以上結(jié)果說明19742-1與19742-2利用碳源的能力相似，但存在一定的差別。

API 20NE試劑條：結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)吲哚產(chǎn)生、精氨酸雙水介酶、脲酶、半乳糖甙酶、癸酸、乙二酸、苯乙酸同化反應(yīng)19742-1和19742-2均為陰性，其余均為陽性。僅葡萄糖酸鹽同化反應(yīng)19742-1顯示為陰性，而19742-2顯示為陽性反應(yīng)。具體如表2所示。

表2 利用BIOLOG GEN III和API 20NE試劑條分析19742-1和19742-2差異

2.3 全細胞脂肪酸分析

脂肪酸測定結(jié)果如表3所示，菌株19742-1與19742-2均含有Bacillus屬中主要的脂肪酸成分，其主 要 脂 肪 酸 均 為 anteiso-C15：0，iso-C15：0，anteiso-C17：0和iso-C17：0，由此可以看出這兩株菌的脂肪酸主要組成相同，只是含量方面略微有差異。

表3 19742-1和19742-2的全脂肪酸分析

2.4 基于16S rRNA基因和持家基因gyrB系統(tǒng)發(fā)育分析

19742-1和19742-2的16S rRNA基因片段長度分別為1 547 bp和1 547 bp，Genbank登錄號分別為MK779999和MK780002，將兩者測序得到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對，表明兩株菌間的16S rRNA基因序列相似性為100%，與B. velezensisCR-502T相似度最高，分別為99.86% 和99.79%。同時，19742-1和19742-2菌株的gyrB基因片段長度分別是1 156 bp和1 163 bp，gyrB基因序列相似性為99.4%，登錄號分別為MK792247和MK792248。構(gòu)建基于16S rRNA和gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果可以看出，19742-1和19742-2 均與B.velezensisCR-502T菌株親緣關(guān)系最近，因此進一步說明二者可能是同一株菌的不同形態(tài)型。

2.5 19742-1和19742-2基因組分析

19742-1的基因組全長為3 883 546 bp，GC含量為46.41%，含有3 897個基因，可編碼3 897個蛋白，Genbank登錄號為SSNF00000000；19742-2基因組全長為3 882 439 bp，GC含量46.59%，含有3 896個基因，可編碼3 896個蛋白，Genbank登錄號為SSNG00000000，二者基因組大小并無很大差別。另外，19742-1基因組中有2161個蛋白序列能與KEGG數(shù)據(jù)庫匹配并得到功能分類；有2 741個基因得到GO分類注釋；基因組中預測到71個tRNA，5個rRNA。而19742-2的基因組中有2 162個蛋白序列能與KEGG數(shù)據(jù)庫匹配并得到功能分類；有2 742個基因得到GO分類注釋；基因組中預測到66個tRNA，4個rRNA。此外，從基因組分析來看，19742-1菌株特有的基因是12個，而19742-2菌株特有的基因是10個。綜上可以看出，19742-1和19742-2菌株在基因組預測方面并無很大差別。

2.6 ANI和DDH值分析

19742-1和19742-2及其與相關(guān)模式菌種的ANI和DDH值見表4所示。根據(jù)計算結(jié)果可知，19742-1和19742-2菌株的ANI值為99.95%，DDH值為99.62%；兩株菌與B. amyloliquefaciensDSM 7T的ANI值分別為93.53% 和93.54%，DDH值分別為66.42% 和66.43%；與B. velezensisNRRL_B 41580T的ANI值分別為97.01% 和97.03%，DDH值分別為77.22% 和77.28%。一般來講，同種之間 ANI值≥ 95%，DDH 值≥ 70%［20］。19742-1和19742-2菌株與B. velezensisNRRL_B 41580T的ANI及DDH值均大于種分類水平的臨界值，而與B.amyloliquefaciensDSM 7T的ANI及DDH值均小于種分類水平的臨界值，因此ACCC 19742屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌。

圖2 鄰接法構(gòu)建19742-1和19742-2菌株16S rRNA和gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 19742-1和19742-2及與其相近種模式菌的ANI和DDH值（%）

3 討論

在細菌分類學上，當同種或同亞種內(nèi)不同菌株之間的性狀差異不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的“型”，但他們不是正式的分類等級［21］。從表型來看，兩株菌具有不同的形態(tài)，19742-2 菌落粘性相對較強，推測其可能含有更多的糖類物質(zhì)，而19742-1菌株表面相對干燥，出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象可能是由于某個特異性基因突變或重組而引起在形態(tài)特征和生理類型等方面的差異［22］。同時，已報道的貝萊斯芽孢桿菌菌落形態(tài)也存在著明顯差異。如王偉等［23］篩選到一株可拮抗大麗輪枝菌的B. velezensis12-51，其菌落形態(tài)呈白色，邊緣整齊且光滑，中間略微凸起，菌體生長物可向四周呈云霧狀擴散。而連彩等［24］分離的抗蘭花枯萎病貝萊斯芽孢桿菌單菌落形態(tài)呈圓形，表面褶皺，菌落中央凹陷呈火山口狀?？梢姡煌腂. velezensis菌株形態(tài)不盡相同。

根據(jù)API 20NE、BIOLOG以及脂肪酸分析等生理生化分析結(jié)果，19742-1和19742-2十分相似，結(jié)合16S rRNA基因、gyrB以及基因組分析，可以確定二者是同一株菌不同的形態(tài)型；從目前的結(jié)果也可以看出，這兩株菌在功能方面并沒有很大的分化，只是形態(tài)結(jié)構(gòu)有所差異。進一步確定了該菌株屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌?；蚪M分析來看，19742-1與19742-2分別具有12個和10個特有基因，可能是由于進化過程中的基因突變和自然選擇適應(yīng)［25］造成的，具體原因還有待我們后續(xù)深入進行探究。

菌落形態(tài)特征是判斷菌種是否污染的最直接、最快速且一直以來認為是無爭議的一種方法，本研究的結(jié)果旨在闡明在微生物檢測、生產(chǎn)及菌種資源的保藏過程中，應(yīng)結(jié)合不同的方法判斷菌種的純度。解淀粉芽孢桿菌及貝萊斯芽孢桿菌均為微生物飼料和微生物肥料重要的生產(chǎn)菌株，本研究修正了ACCC 19742的分類地位，從不同角度證明了同一株菌存在不同的菌落和菌體形態(tài)。本研究為微生物肥料以及飼料等相關(guān)微生物產(chǎn)品的檢測，尤其對于菌種保藏中心保藏及共享工作提供了重要參考價值。

4 結(jié)論

本文通過形態(tài)學、生理生化、基因組等多方面綜合分析，證實19742-1和19742-2為來源于同一菌株的不同形態(tài)，而并非污染造成；同時根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹、ANI和DDH值分析得知，該菌株ACCC 19742 的分類地位屬于貝萊斯芽孢桿菌而并非解淀粉芽孢桿菌，研究結(jié)果對菌種保藏工作具有一定指導意義。