莊世芳，王艷華

西安交通大學(xué)附屬西安市第九醫(yī)院檢驗科1、病理科2，陜西 西安 710054

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病，其患患者數(shù)和流行程度呈逐年增加趨勢[1]。糖尿病患者患中風(fēng)、血管性癡呆、阿爾茨海默病等神經(jīng)障礙的風(fēng)險顯著增加，且糖尿病與這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生都伴隨腦微血管結(jié)構(gòu)和功能的異常[2-3]。丙酮醛(methylglyoxal，MGO)是糖酵解過程中的副產(chǎn)物，慢性高血糖引起MGO代謝增加，MGO增多是導(dǎo)致糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能喪失的關(guān)鍵始動因素[4-5]。阿司匹林是一種非甾體類抗炎藥，通過不可逆性抑制環(huán)氧酶活性發(fā)揮抗炎、止痛、抗血小板作用[6]。糖尿病患者通過每日服用低劑量阿司匹林(aspirin，ASA)來預(yù)防心血管不良事件的發(fā)生。研究表明，服用阿司匹林還能夠減少糖尿病患者發(fā)生癡呆的風(fēng)險[7]，但這是否與降低MGO引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)目前并不清楚。本研究旨在探討阿司匹林對MGO引起的人血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及調(diào)控機制，為糖尿病并發(fā)癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細(xì)胞培養(yǎng)基配方均購自美國Gibco公司。阿司匹林、40%丙酮醛水溶液購自美國Sigma公司。WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。LC3及GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)由法國Institut Cochin提供，培養(yǎng)液為RPMI 1640，添加10%胎牛血清，置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%后，倒掉培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，凍存或用于實驗。

1.3 藥物干預(yù)及分組 40%丙酮醛水溶液采用去離子水稀釋，阿司匹林粉末溶于相應(yīng)體積的二甲基亞砜(DMSO)，分別制成不同濃度的儲備液，并通過細(xì)胞培養(yǎng)液將藥物按照1:1 000的比例稀釋為工作液。所有實驗處理方法均為細(xì)胞在含不同藥物濃度的培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行相應(yīng)結(jié)果的檢測分析。首先檢測不同濃度的丙酮醛或阿司匹林對細(xì)胞活力的影響，然后將細(xì)胞進(jìn)行分組處理：對照組(培養(yǎng)液加入對應(yīng)體積的DMSO或去離子水)、MGO處理組(培養(yǎng)液加入1 mmol/L的MGO)、MGO聯(lián)合阿司匹林處理組(培養(yǎng)液加入1 mmol/L的MGO和不同濃度的阿司匹林)。每個實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞活力檢測 將單細(xì)胞懸液加入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，5×103個/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時，將細(xì)胞進(jìn)行分組處理。24 h后，按照試劑盒說明書加入WST-1溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度。

1.5 Caspase-3活性檢測 將細(xì)胞分組處理，然后按照試劑盒說明書操作。

1.6 活性氧水平檢測 利用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)進(jìn)行活性氧檢測。將單細(xì)胞懸液加入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時，對細(xì)胞進(jìn)行分組處理。實驗結(jié)束后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積DCFH-DA，37℃孵育20 min。然后用無血清1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡拍照。利用Image J軟件統(tǒng)計每個視野中活性氧(ROS)陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 收集6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)裂解，蛋白質(zhì)定量(BCA)法定量蛋白濃度，每孔上樣30μg，聚丙烯酰胺凝聚電泳并轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉條帶，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組均數(shù)間比較采用One-way ANOVA和Newman-Keuls進(jìn)行顯著性檢驗，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGO對細(xì)胞活力的影響 采用不同濃度的MGO(0.1～10 mmol/L)處理hCMEC/D3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力隨著MGO濃度提高而逐步降低；當(dāng)MGO濃度達(dá)到1 mmol/L時，細(xì)胞活力為(79.72±5.01)%，與0 mmol/L MGO組的(100.00±2.45)%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 MGO對細(xì)胞活力的影響

2.2 阿司匹林對細(xì)胞活力的影響 采用不同濃度的阿司匹林(0.1～1 mmol/L)處理hCMEC/D3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力隨著阿司匹林濃度提高而逐步降低；當(dāng)阿司匹林濃度為0.5 mmol/L或1 mmol/L時，細(xì)胞活力為分別為(87.72±3.36)%和(81.55±2.85)%，與0 mmol/L阿司匹林組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 阿司匹林對細(xì)胞活力的影響

2.3 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞活力的影響 聯(lián)合應(yīng)用1 mmol/L的MGO和不同濃度的阿司匹林(0.1～1 mmol/L)處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力隨阿司匹林濃度提高而逐步降低；當(dāng)所用阿司匹林濃度為0.5 mmol/L或1 mmol/L時，細(xì)胞活力分別為(67.33±6.47)%和(59.40±5.12)%，與MGO處理組的(80.16±3.50)%比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3，提示阿司匹林加重MGO引起的細(xì)胞損傷。

2.4 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞Caspase-3活性的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3細(xì)胞24 h后，Caspase-3活性為(112.38±4.62)%，較對照組的(100.00±2.32)%有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。MGO聯(lián)合阿司匹林處理細(xì)胞則進(jìn)一步提高Caspase-3活性，當(dāng)阿司匹林濃度為0.5 mmol/L，Caspase-3活性為(120.13±4.41)%，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；當(dāng)阿司匹林濃度為1 mmol/L時，Caspase-3活性為(133.13±7.23)%，與對照組或MGO處理組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶，提示阿司匹林可能會促進(jìn)hCMEC/D3細(xì)胞凋亡。

圖3 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞活力的影響

圖4 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞Caspase-3活性的影響

2.5 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，與對照組相比，ROS陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；MGO聯(lián)合不同濃度的阿司匹林處理細(xì)胞后，ROS陽性的細(xì)胞數(shù)均較MGO處理組進(jìn)一步增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

2.6 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞自噬水平的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)比值較對照組上升至4.7倍(P＜0.05)，然而阿司匹林能夠完全抑制MGO引起的LC3Ⅱ表達(dá)增加，見圖6。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化是自噬激活的標(biāo)志，這提示阿司匹林抑制丙酮醛引起的細(xì)胞自噬。

圖5 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響(20×)

圖6 丙酮醛聯(lián)合阿司匹林處理對細(xì)胞自噬水平的影響

3 討論

血腦屏障是腦組織與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的窗口，能夠阻止神經(jīng)毒性物質(zhì)、血細(xì)胞、病原體進(jìn)入腦中，其正常的結(jié)構(gòu)和功能對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)具有重要意義，血腦屏障破壞則與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。糖尿病患者持續(xù)的高血糖狀態(tài)及繼發(fā)的炎癥和組織缺氧等導(dǎo)致體內(nèi)大量蓄積丙酮醛，并促進(jìn)晚期糖基化產(chǎn)物形成。丙酮醛與蛋白質(zhì)精氨酸殘基結(jié)合，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、功能喪失和靶向降解，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷和功能失常[4]。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的主要組成部分。因此，抑制MGO引起的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷有望減輕糖尿病相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。

臺灣地區(qū)的一項研究表明，每日服用低劑量阿司匹林能夠降低2型糖尿病患者發(fā)生阿爾茨海默病的風(fēng)險[7]。其中的機制是否與減少MGO引起的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)目前并不清楚。然而本研究發(fā)現(xiàn)，MGO及阿司匹林均濃度依賴性抑制hCMEC/D3細(xì)胞活力，MGO聯(lián)合阿司匹林處理則進(jìn)一步降低細(xì)胞活力，表明阿司匹林會加重丙酮醛引起的細(xì)胞損傷。Caspase是一個在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶，也是哺乳動物中研究最多的一個Caspase[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠進(jìn)一步提高M(jìn)GO引起的Caspase-3活性增加，表明阿司匹林可能會促進(jìn)hCMEC/D3細(xì)胞凋亡。盡管丙酮醛在體內(nèi)可通過多種途徑損害內(nèi)皮細(xì)胞功能，但其危害主要跟增加ROS產(chǎn)生有關(guān)[10]。ROS是指包含氧原子的自由基，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)和羥自由基(OH-)等。ROS增多對DNA、蛋白質(zhì)和脂類進(jìn)行氧化破壞，使細(xì)胞膜完整性受損，細(xì)胞器功能喪失，并最終導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與MGO處理組相比，MGO聯(lián)合阿司匹林處理能夠顯著提高細(xì)胞ROS水平，表明阿司匹林能夠促進(jìn)hCMEC/D3細(xì)胞氧化應(yīng)激。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種依賴于溶酶體的降解途徑，也是細(xì)胞重要的自我保護(hù)機制，對于清除細(xì)胞內(nèi)活性氧具有重要意義[12]。相關(guān)研究證實，激活自噬能夠減輕中風(fēng)發(fā)生后MGO造成的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)比值較對照組上升至4.7倍，然而阿司匹林能夠完全抑制MGO引起的LC3Ⅱ表達(dá)增加。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化是自噬激活的標(biāo)志，說明阿司匹林具有很強的自噬抑制作用。綜上所述，阿司匹林加重MGO引起的hCMEC/D3損傷，可能與其提高細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

盡管阿司匹林能夠降低糖尿病患者發(fā)生癡呆的風(fēng)險，但是這種作用似乎并不依賴于減輕MGO引起的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷，相反它會加重MGO引起的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷。阿司匹林更加深入詳細(xì)的藥理作用機制還有待于進(jìn)一步研究。