張夢穎，郭瑞敏，孫燕妮

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200062

肺泡是肺部進(jìn)行氣體交換的主要單位，肺泡上皮是空氣中病原體、過敏原和污染物的屏障，在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)肺的重塑、修復(fù)和維持穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[1]。成熟的肺泡上皮由Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar type Iepithelial cells，ATI)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar typeⅡepithelial cells，ATⅡ)組成，它們分別占肺泡表面的95%和5%[2]。ATI是鱗狀上皮細(xì)胞，覆蓋在肺泡表面，主要與鄰近的毛細(xì)血管組成氣-血屏障進(jìn)行交換氣體，維持氣液界面的離子和液體平衡[3]，其中散布著立方型Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞[4]。ATⅡ是肺泡上皮的重要組成部分，呈立方形，細(xì)胞表面有特征性的微絨毛以及胞質(zhì)內(nèi)有嗜鋨性板層小體[5]。板層小體通過釋放表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(pulmonary surfatcant-associated protein，SP)對(duì)降低肺泡表面張力，防止肺泡塌陷，穩(wěn)定肺泡形態(tài)非常重要[6]。ATⅡ又被稱為“祖細(xì)胞”，當(dāng)肺泡上皮受損時(shí)，一小部分成熟的ATⅡ既可以不斷分化成為ATI，促進(jìn)肺泡上皮再生及修復(fù)，保持肺部穩(wěn)態(tài)，又可以更新生成新的ATⅡ[7]。同時(shí)ATⅡ還參與肺水轉(zhuǎn)運(yùn)，免疫調(diào)節(jié)[8]等。因此ATⅡ不僅是肺的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和防御細(xì)胞，也是許多肺部疾病的靶細(xì)胞，包括ARDS[9]，肺纖維化[10]，急性肺損傷等[11]，慢性阻塞性肺疾病[12]以及新生兒的肺部感染等[13]。但是，目前在一些肺部疾病的研究領(lǐng)域中使用的肺泡上皮細(xì)胞系，不能很好地代表肺泡上皮細(xì)胞，也不能完全模擬肺部疾病模型[14]。且Ⅱ型上皮細(xì)胞在原代培養(yǎng)過程中，會(huì)逐漸分化成為ATI，因此，對(duì)于要求較高的實(shí)驗(yàn)采用原代分離獲取Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞會(huì)相更為理想。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年清潔級(jí)SD大鼠，雌、雄(180～200 g)各一只。合籠21 d分籠，可得新生鼠(普陀區(qū)中心醫(yī)院動(dòng)物房提供)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 無菌工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機(jī)，倒置顯微鏡，透射電鏡(上海中醫(yī)藥大學(xué)提供)，共聚焦顯微鏡。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、HBSS緩沖液、胎牛血清、Anti-Anti試劑、0.25%胰蛋白酶(Gibco)，膠原酶Ⅰ(1G，Sigma)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Solarbio)，大鼠IgG(10 mg，上海翊圣生物有限公司生物)，BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒(江蘇凱基生物有限公司)，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率試劑盒、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、Hoechst 33342染色液(上海碧云天生物有限公司)，紅細(xì)胞裂解液(Biosharp)，4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物)，Anti-SPC(北京博奧森生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分離 取3只出生3 d內(nèi)SD大鼠，75%酒精浸泡1 min，在無菌操作臺(tái)中打開胸腔，摘取肺(盡量去除氣管、支氣管等組織)，在含Anti-Anti的HBSS溶液中沖洗，直至溶液清亮。將肺組織轉(zhuǎn)移至含DMEM培養(yǎng)基的100 mm2培養(yǎng)皿中，剪成1 mm3大小，棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶(含EDTA，每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化10 min。加入等量的含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后棄去液體。加入0.25%胰蛋白酶(含EDTA，每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化15 min，加入等量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻，將液體移至50 mL離心管中。加入0.1%膠原酶Ⅰ(每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化20 min，加入等量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，將液體移至50 mL離心管中。重復(fù)上述步驟3次。將收集的液體，200目濾網(wǎng)過濾(自然濾過，不使用外力)，收集濾液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入5 mL含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的純化 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，1 000 r/min，離心5 min，重復(fù)上述步驟3次。將未貼壁細(xì)胞吸出，轉(zhuǎn)移至用大鼠IgG(1 mg/mL)包被的培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。純化結(jié)束后，離心1 000 r/min，5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，體積為細(xì)胞沉淀的3～5倍，輕輕吹打，裂解1～2 min，離心(400～500)×g，5 min，棄上清。若紅細(xì)胞裂解不完全，可重復(fù)裂解。

1.2.3 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 純化后，將未貼壁細(xì)胞吸出，1 000 r/min，離心5 min，用含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，將分離得到的細(xì)胞濃度調(diào)整為(1～3)×106/mL接種于6孔板，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。

1.3 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的鑒定

1.3.1 透射電鏡鑒定 細(xì)胞貼壁后，會(huì)用0.25%胰酶消化細(xì)胞，含10%FBS的DMEM終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加0.5 mL 5%戊二醛固定。制備為電鏡細(xì)胞標(biāo)本，于透射電鏡下觀察肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的特征性板層小體(嗜鋨小體)。

1.3.2 免疫熒光鑒定(共聚焦顯微鏡) 細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。加入PBS稀釋的SP-C一抗(1∶500)，4℃孵育24 h，PBS洗3次。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：500)37℃孵育2 h，PBS洗3次。加入Hoechst 33342染色液1 mL，室溫避光孵育20 min，PBS洗2～3次，每次3～5 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3 BCIP/NBT堿性磷酸酶試劑盒鑒定 細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS洗1～2次，4%的多聚甲醛(覆蓋細(xì)胞即可)固定細(xì)胞20 min，PBS洗3～5次，每次5 min，按照說明書配置BCIP/NBT工作液，室溫避光5～30 min或更長(24 h)，去除BCIP/NBT工作液，蒸餾水洗1～2次，終止顯色反應(yīng)。室溫避光晾干，于顯微鏡下觀察。并計(jì)算細(xì)胞純度。

1.4 細(xì)胞活力測定 純化完成后，取少量細(xì)胞懸液1 000 r/min，離心1 min，棄上清，500μL細(xì)胞重懸液重懸細(xì)胞，吸取100μL重懸的細(xì)胞到離心管內(nèi)，加入100μL臺(tái)盼藍(lán)染色液，輕輕混勻，染色3～5 min。染色完成后，吸取少量染色后的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，至少數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=(細(xì)胞總數(shù)－藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)描述。

2 結(jié)果

2.1 原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞呈單層平鋪在培養(yǎng)皿中，立方形，呈島狀生長，胞漿內(nèi)可見黑色顆粒，見圖1。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)24 h

2.2 透射電鏡鑒定 電鏡下可觀察到細(xì)胞呈不規(guī)則圓形，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)胞器，并有黑色板層小體，細(xì)胞膜上有微絨毛，見圖2。

圖2 細(xì)胞電鏡

2.3 免疫熒光鑒定 共聚焦顯微鏡下可觀察到胞質(zhì)內(nèi)呈綠色熒光的SP-C表達(dá)，以及呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，見圖3。

圖3 共聚焦顯微鏡

2.4 BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定 顯微鏡下可看到細(xì)胞胞漿內(nèi)含藍(lán)紫色顆粒，見圖4。細(xì)胞純度≥92%。

圖4 BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定

2.5 細(xì)胞活力鑒定 原代ATⅡ培養(yǎng)24 h活力為(94.82±1.64)%，胞純度為(95.96±0.90)%。

3 討論

原代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分離提取，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇多種多樣，有選擇用成年SD大鼠[15]或小鼠[16]，麻醉后氣管插管，灌注消化液消化一定時(shí)間后，整體取出心肺，將肺組織剪碎繼續(xù)消化分離細(xì)胞。此方法所使用的成年鼠成本較高，利用率低，且易污染。或選擇胎鼠，整體取出肺，進(jìn)行消化分離細(xì)胞。此方法需對(duì)雌鼠進(jìn)行剖腹，再對(duì)胎鼠進(jìn)行剖胸，過程繁瑣，且因雌鼠個(gè)體差異，剖腹獲得的胎鼠不一定滿足實(shí)驗(yàn)需要。本實(shí)驗(yàn)采用出生3 d內(nèi)的新生鼠，將雌鼠、雄鼠按照2∶1合籠，21 d左右分籠，即可獲得大批的新生鼠，實(shí)驗(yàn)成本較低且容易獲得。

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的消化分離，主要選用胰蛋白酶，膠原酶和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶消化作用好，性質(zhì)溫和，分離出細(xì)胞純度在90%以上[15]，但價(jià)格昂貴且不易獲得。胰蛋白酶可以使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，破壞細(xì)胞間的連接從而使細(xì)胞離散。常用工作濃度為0.25%，在pH為8.0，溫度為37℃時(shí)，胰蛋白酶的作用最強(qiáng)。采用0.25%(含EDTA)的胰蛋白酶，消化時(shí)間為15 min，避免了因消化過度而造成細(xì)胞損傷，且其中所含的EDTA能夠螯合Ca2+和Mg2+，從而破壞細(xì)胞連接促進(jìn)細(xì)胞解離，與胰蛋白酶聯(lián)用，消化效果更好。膠原酶主要水解組織中的膠原成分，僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大，其中膠原酶Ⅰ主要用于上皮、肺、脂肪和腎上腺組織的細(xì)胞分離，與0.25%胰蛋白酶交替使用，消化效果較好。

張秋月等[17]采用0.25%胰蛋白酶消化后，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾。離心再加入0.1%膠原酶消化，再經(jīng)離心純化。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶消化過程結(jié)束后，產(chǎn)生的膠原成分使殘余肺組織及消化下來的細(xì)胞黏連在一起，不能很好的通過200目濾網(wǎng)，過濾困難，因此在終止消化后選用3 mL無菌吸管輕輕吹打，將肺組織吹至離散狀態(tài)后能明顯看到消化液變渾濁，再收集上清。加入適量膠原酶Ⅰ繼續(xù)消化，再收集上清。并增加了兩次胰蛋白酶-膠原酶的交替消化過程。將三次消化后所收集的上清經(jīng)200目濾網(wǎng)統(tǒng)一過濾。

酶消化后的細(xì)胞懸液中除了AT-Ⅱ外，還有成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。為了獲取高純度的Ⅱ型上皮細(xì)胞一般采用密度梯度離心法、差速貼壁法、免疫黏附、流式分選等。因成纖維細(xì)胞較上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間短，故先采用差速貼壁法來去除成纖維細(xì)胞。大鼠IgG免疫黏附法是近年來最常采用的純化方法，新生鼠肺消化得到的細(xì)胞懸液中肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等表面有Fc受體，可以與IgG結(jié)合，貼壁在大鼠IgG包被過的培養(yǎng)皿上。而AT-Ⅱ表面沒有Fc受體，不會(huì)與IgG結(jié)合，所以經(jīng)大鼠IgG免疫黏附純化后的未貼壁細(xì)胞即為AT-Ⅱ[18]。摘取肺組織過程中，不能全部去除紅細(xì)胞，因此在細(xì)胞純化結(jié)束后加入了紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。若是不進(jìn)行純化后計(jì)數(shù)等實(shí)驗(yàn)操作，因紅細(xì)胞不貼壁，可通過換液去除紅細(xì)胞。

原代AT-Ⅱ的鑒定方法有很多種，電鏡是鑒定AT-Ⅱ的金標(biāo)準(zhǔn)，電鏡能夠非常直觀的看到AT-Ⅱ胞漿內(nèi)有板層小體，各種細(xì)胞器以及細(xì)胞表面的微絨毛，但價(jià)格昂貴。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的表面活性物質(zhì)(pulmonary surfatcant-associated protein，SP)有四種相關(guān)蛋白包括SP-A，SP-B，SP-C和SP-D，尤其是SP-C僅在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)，采用免疫熒光法，共聚焦顯微鏡下可觀察到綠色熒光表達(dá)的SP-C，因此也可作為鑒定肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的依據(jù)[19]。AKP是AT-Ⅱ分劃標(biāo)記物，可適用于區(qū)別巨噬細(xì)胞。曾慶富[20]采用BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定ATⅡ，細(xì)胞內(nèi)AKP反應(yīng)物呈深藍(lán)色。該方法簡便有效且十分經(jīng)濟(jì)。本實(shí)驗(yàn)中分別采取電鏡、共聚焦顯微鏡以及BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒對(duì)提取的原代AT-Ⅱ進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果理想。

除離心操作外，整個(gè)過程均在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。所用手術(shù)器械經(jīng)高溫滅菌，消化液及清洗組織的HBSS都含有抗生素，從未出現(xiàn)細(xì)胞污染。此次從降低細(xì)胞污染概率、消化時(shí)長及次數(shù)、純化過程以及細(xì)胞過濾方面等進(jìn)行了改進(jìn)。整個(gè)過程耗時(shí)6 h左右，并獲得了較高純度且產(chǎn)量不低的AT-Ⅱ，可滿足體外實(shí)驗(yàn)的需求。此次實(shí)驗(yàn)仍有許多不足，原代細(xì)胞的分離方法雖簡單但是耗時(shí)過長，仍需要不斷地改進(jìn)與優(yōu)化。