馬躍新，聶根宇,李維莉*

(1．昆明市食品藥品檢驗(yàn)所 藥品檢驗(yàn)中心，云南 昆明 650032；2.昆明學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650214)

滇金銀花(FloraLoniceraebournei)為忍冬科植物西南忍冬(LonicereibourneiHemsl.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，在云南常作為藥用金銀花的地方習(xí)用品，收載于2005年版《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)：第7冊(cè)》．該藥材在《全國(guó)中草藥匯編》中稱為“短唇忍冬”，在《云南中藥資源名錄》中稱為“西南忍冬”，為了與2015年版《中華人民共和國(guó)藥典：一部》[1]收載的“金銀花”區(qū)別，將該藥材名稱確定為“滇金銀花”．滇金銀花主要產(chǎn)于云南省的峨山、雙柏、建水、思茅、勐臘等地．2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第7冊(cè)》[2]顯示，滇金銀花中主要含有綠原酸等酚性成分、木犀草素和金絲桃苷等黃酮成分，以及三萜皂苷、揮發(fā)油等．目前，使用高效液相色譜法測(cè)定金銀花中綠原酸的含量已有許多報(bào)道[3-6]，但對(duì)滇金銀花含量測(cè)定的報(bào)道卻較少．因此，本研究嘗試建立反相高效液相色譜法測(cè)定滇金銀花中綠原酸含量的方法，以期為評(píng)價(jià)滇金銀花的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藥材

滇金銀花3批(批號(hào)：160901；170802；161101)，經(jīng)檢驗(yàn)均為滇金銀花．

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，帶紫外檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；MS205DU電子天平(梅特勒公司，1/100 000)，AL204電子天平(梅特勒公司，1/10 000)；DFY-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；KQ 5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CHORUS超純水系統(tǒng)(英國(guó)ELGA公司)．

1.3 試藥與試劑

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201716)；乙腈(德國(guó)默克集團(tuán)，批號(hào)：JA054230，色譜純)；磷酸(四川西隴化工有限公司，批號(hào)：170512，分析純)；甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170712，分析純)；水為GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取綠原酸 25.00 mg，置 50 mL 棕色容量瓶，加50%甲醇制成每 1 mL 含 500 μg 的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液．

1.4.2 供試品溶液的制備

取過(guò)4號(hào)篩的該藥材粉末 0.5 g，精密稱定其質(zhì)量，平行取樣2份，準(zhǔn)確加入50%甲醇溶液 100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 30 min，放置至室溫，稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取續(xù)濾液 5 mL，置于 25 mL 的棕色量瓶，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液．

1.4.3 液相條件

色譜柱為Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90，流速 1.0 mL/min，柱溫 40 ℃，進(jìn)樣量 10 μL．對(duì)照品溶液色譜圖如圖1，供試品溶液色譜圖如圖2．

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性考察

將制備好的供試品溶液與對(duì)照品溶液按1.4.3項(xiàng)下條件注入液相色譜儀進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察，結(jié)果理論板數(shù)均大于 8 000，供試品中主色譜峰綠原酸與前后雜峰的分離度均大于3.0．

2.2 線性關(guān)系考察

分別取1.4.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，20.00 mL 至 100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，100.00 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液．按1.4.3項(xiàng)下條件進(jìn)樣，然后以峰面積A為縱坐標(biāo)，以綠原酸含量C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖3)，回歸方程為A=14.583 83C+4.978 55，R=0.999 90．

2.3 檢出限及定量限考察

2.3.1 儀器檢出限和定量限考察

取對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度 5.00 μg/mL)分別稀釋至信號(hào)/噪音比為S/N=1∶3和S/N=1∶10時(shí)，通過(guò)計(jì)算得到儀器所對(duì)應(yīng)的檢出限為 0.051 7 μg/mL，定量限為 0.164 μg/mL．

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 方法檢出限和定量限考察

取供試品溶液(批號(hào)160901)分別稀釋至信號(hào)/噪音比為為1∶3和1∶10時(shí)，計(jì)算得到方法檢出限為 0.053 8 μg/mL，定量限為 0.182 μg/mL．

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取滇金銀花(批號(hào)160901)，按樣品制備條件1.4.2制備的供試品溶液，平行制備6份，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到供試品質(zhì)量濃度，供試品中綠原酸的RSD為0.09%，結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上述實(shí)驗(yàn)得出RSD小于2.0%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好．

2.5 精密度考察

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與對(duì)照品溶液4(即質(zhì)量濃度 40 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到供試品質(zhì)量濃度，計(jì)算得到RSD為0.07%，結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上述實(shí)驗(yàn)得出RSD小于2.0%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)有較好的精密度．

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.6.1 時(shí)間穩(wěn)定性考察

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液(批號(hào)160901)分別在0，12，24，48，72，96 h 進(jìn)樣分析，以所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，并計(jì)算平均質(zhì)量濃度與RSD，得到供試品中綠原酸的RSD為1.1%，結(jié)果見(jiàn)表3．

由上述實(shí)驗(yàn)得出RSD小于2.0%，說(shuō)明供試品溶液在 96 h 內(nèi)穩(wěn)定．

2.6.2 柱溫穩(wěn)定性考察

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液(批號(hào)160901)分別在柱溫為20，30，40 ℃ 進(jìn)樣分析，每次平行進(jìn)樣4次，以所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得質(zhì)量濃度，并計(jì)算平均質(zhì)量濃度和RSD，得到供試品中綠原酸的RSD為1.2%，結(jié)果見(jiàn)表4．

表3 時(shí)間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 柱溫穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上述實(shí)驗(yàn)得出RSD小于2.0%，說(shuō)明供試品溶液測(cè)定柱溫在20～40 ℃ 的測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定．

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取1份已知含量的滇金銀花粉末樣品 0.50 g，加入適量綠原酸對(duì)照品，按樣品制備方法操作，制成含對(duì)照品 25 μg/mL 的加標(biāo)溶液，進(jìn)行分析，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，依次計(jì)算回收率．使用樣品(批號(hào)160901)制備加標(biāo)溶液6份，同時(shí)平行制備樣品溶液．得到平均回收率為101.1%，RSD為0.3%，結(jié)果見(jiàn)表5．

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取每批滇金銀花粉末樣品各兩份，每份 0.5 g，按樣品制備方法分別制備供試品溶液，每份進(jìn)樣測(cè)定2次，計(jì)算樣品的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表6．

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

因綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基，遇光很不穩(wěn)定，考慮到該因素，綠原酸對(duì)照品溶液及供試品溶液用棕色的容量瓶盛放，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性．

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑選擇時(shí)，比較了乙醇、甲醇、50%乙醇溶液和50%甲醇溶液，最后選擇峰形和提取率更好的50%甲醇溶液．

在綠原酸含量測(cè)定的過(guò)程中，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行比較，最終選取最佳方案為加入50%的甲醇溶液進(jìn)行超聲處理(功率 250 W，頻率 35 kHz)30 min．對(duì)流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，經(jīng)比較認(rèn)為以V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90為流動(dòng)相峰形及分離度效果最好，檢測(cè)波長(zhǎng)在 327 nm 處各色譜峰之間分離效果最佳．

在系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在不同品牌液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾液相、島津液相)條件下測(cè)定綠原酸的理論塔板數(shù)與分離度，所得結(jié)果理論塔板數(shù)均大于 8 000，分離度均大于1.5，滿足文獻(xiàn)[1]中的標(biāo)準(zhǔn)要求．

樣品的生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間、儲(chǔ)存條件等因素均可能影響到滇金銀花中綠原酸的含量，這可能是造成表6中樣品含量差異較大的原因之一．

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重復(fù)性RSD為0.09%，精密度RSD為0.07%，回收率RSD為0.3%，說(shuō)明采用反相高效液相色譜法測(cè)定滇金銀花中主要成分綠原酸的含量，方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、精確，可為評(píng)價(jià)滇金銀花的質(zhì)量提供參考依據(jù)．