姚麗媛，戴利利，陳子牛，2，郭麗紅

(1．昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；2．云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 昆明 650214；3．昆明學(xué)院 研究生處，云南 昆明 650214)

近年來，植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為環(huán)境脅迫中的重要信號分子，其研究范圍越來越深入廣泛．研究[1-5]表明，植物在高溫、低溫、干旱、鹽脅迫等逆境中體內(nèi)ABA迅速積累而增強抗逆性．熱激因子(Heat shock transcription factor，HSF)是真核生物中相對保守的一個轉(zhuǎn)錄因子家族[6]．作為逆境信號傳導(dǎo)通路中的重要成員，它能直接啟動下游抗逆境基因的表達，從而提高抗逆境的能力[7-10]．有資料顯示：擬南芥熱激因子HsfA6b作為ABA信號通路下游的一個正調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)，是耐熱性建立所必需的[11]；小麥熱激因子TaHsfC2a通過ABA介導(dǎo)的調(diào)控途徑構(gòu)建了耐熱機制[12]；并且外源ABA能通過H2O2上調(diào)水稻葉片中熱激因子OsHsfA4a和OsHsfA2a的表達[13]．盡管研究顯示，在逆境中ABA能調(diào)控部分熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF的表達，但關(guān)于ABA與轉(zhuǎn)錄因子HSF如何從生理水平協(xié)同提高抗逆性的研究相對較少．眾所周知，在自然界中植物往往通過自身的生理防御系統(tǒng)保護自己免受逆境的傷害．已知植物在逆境中會產(chǎn)生大量的活性氧(AOS)，活性氧會導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的氧化損傷[14-16]．而植物細(xì)胞存在抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD(EC，1.15.11)，CAT(EC，1.11.1.6)，GR(EC，1.6.4.2)和APX(EC，1.11.1.7)，在逆境中它們的活性可得到不同程度的增強，能將活性氧控制在細(xì)胞可以忍耐的水平[17-23]．大量研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，外源ABA在逆境中會提高抗氧化酶的活性而降低氧化脅迫的傷害．本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，過量表達擬南芥熱激因子AtHsfA1a植株中的抗氧化酶 SOD、CAT和APX活性會明顯增強[17]而降低滲透脅迫．哪ABA與擬南芥熱激因子AtHsfA1a是否會影響逆境生理指標(biāo)存在協(xié)調(diào)效應(yīng)，值得進一步研究．

為了研究外源ABA對擬南芥熱激因子AtHsfA1a在低溫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響，采用AtHsfA1a基因T-DNA插入的突變體及野生型的擬南芥幼苗為材料，在冷脅迫下分析AtHsfA1a突變體及野生型植株的逆境生理生化指標(biāo)MDA、H2O2、SOD、CAT、GR和APX變化，以及擬南芥熱激因子AtHsfA1a在響應(yīng)熱脅迫中ABA的生理調(diào)控作用，以期為進一步研究植物耐逆境機理奠定生理基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

采用擬南芥哥侖比亞種(Arabidopsis thaliana，Ecotype Columbia)的T-DNA插入AtHsfA1a基因突變型(SALK-068042，簡稱MT)為實驗材料，以野生型(簡稱WT)為實驗對照．實驗材料購于美國生物資源中心ABRC．

1.2 方法

1.2.1 材料栽培及低溫處理

兩種基因型(MT和WT)種子依次用0.1%的HgCl2和體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進行滅菌處理，在無菌條件下播種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：溫度 22 ℃、光照 12 000 lx 16 h/d．取4周的擬南芥幼苗浸沒在SIB Buffer(0.5 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L KH2PO4，1%蔗糖，pH6.0)中，低溫 4 ℃ 處理 2 d．以 22 ℃ 為對照實驗的處理溫度．

1.2.2 MDA測定

取低溫處理過的小苗 500 mg 在液氮中研碎，懸浮于 5 mL 10%的三氯乙酸中．采用TBA法對植物葉片的MDA進行測定，測定450，532，600 nm 波長下的吸光度值，根據(jù)C=6.45(A532-A600)-0.56A450計算MDA濃度[18]．

1.2.3 H2O2測定

取低溫處理過的小苗 500 mg 在液氮中研碎，懸浮于 1.5 mL 100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中(pH6.8)．H2O2濃度分析按照Gay and Gebicki 2000年的方法[19]．

1.2.4 抗氧化酶活性測定

1)酶的提?。〉蜏靥幚磉^的小苗 500 mg，加入 5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)，內(nèi)含20%甘油，1 mmol/L ASA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L GSH及 5 mmol/L MgCl2，在冰上研磨后，提取液在4 ℃下，經(jīng)過 20 000×g離心30 min，上清液用來測定酶活性．

2)酶活性測定．SOD活性的測定方法參照Zhang等[20]的方法，以加入鄰苯三酚來啟動反應(yīng)，同時每 30 s 記錄1次 319.5 nm 處的吸光值，共測 4 min；CAT活性的測定方法參照Aebi[21]的方法，在 240 nm 下測定；APX活性的測定方法參照Rao等[22]的方法，在 290 nm 下測定；GR的測定參照Kn?rzer等[23]方法，以基于NADPH的氧化作用在 340 nm 下的吸光度的減少來衡量；蛋白質(zhì)含量的測定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford[24]的方法．

2 實驗結(jié)果

2.1 ABA對AtHsfA1a突變型幼苗在冷脅迫下MDA的影響

MDA是膜脂過氧化后最重要的產(chǎn)物之一，其濃度可以反映植物細(xì)胞膜遭受逆境傷害的程度．從圖1可看出，在低溫下不同基因型擬南芥幼苗中MDA濃度均升高，但突變型擬南芥(MT)MDA的濃度較野生型(WT)高，在加入外源ABA處理后，無論突變型還是野生型MDA的濃度都有所下降，但突變型下降幅度較小，表明外源ABA抑制MDA的形成與熱激因子AtHsfA1a呈正相關(guān)，說明外源ABA和AtHsfA1a協(xié)同降低MDA濃度，從而降低低溫對細(xì)胞膜傷害．

2.2 ABA對AtHsfA1a突變型幼苗在冷脅迫下H2O2的影響

過氧化氫(H2O2)作為一類重要的活性氧和信號分子，其濃度的高低可以有效衡量細(xì)胞的受傷程度．從圖2可看出，在常溫下2種基因型的H2O2濃度差異不大，而在低溫脅迫下，突變型擬南芥所含的H2O2濃度升高較野生型明顯，加入外源ABA處理后不同基因型在低溫下擬南芥所含H2O2都有一定程度降低，但突變型擬南芥所含的H2O2濃度降低較野生型小，說明外源ABA在低溫下對H2O2濃度影響與熱激因子AtHsfA1a有關(guān)，在低溫下外源ABA和AtHsfA1a協(xié)同降低了H2O2濃度，從而降低低溫產(chǎn)生活性氧的傷害．

2.3 ABA對AtHsfA1a突變型幼苗在冷脅迫下抗氧化酶的影響

大量研究[17-23]發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶系統(tǒng)活性的增強與提高植物的抗逆性密切相關(guān)．本研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫處理可以使突變型和野生型植株SOD，CAT，GR和APX的活性不同程度升高(圖3)，野生型植株的抗氧化酶活性升高均明顯大于突變型植株的抗氧化酶活性．外源ABA處理后對野生型植株的抗氧化酶活性升高影響較大，而對突變型植株的抗氧化酶活性影響較小(圖3a，3b，3c，3d)，表明外源ABA提高抗氧化酶活性是與熱激因子AtHsfA1a有協(xié)同效應(yīng)，低溫下外源ABA和AtHsfA1a協(xié)同提高抗氧化酶活性而降低活性氧對植物的傷害，從而提高植物的抗冷性．

3 結(jié)果與討論

近年來，植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為環(huán)境脅迫中的重要信號分子，能調(diào)控一些熱激轉(zhuǎn)錄因子的表達和活性[11-13]，但ABA調(diào)控?zé)峒まD(zhuǎn)錄因子后的生理生化過程尚有待于進一步地探討．熱激因子(Heat shock transcription factor，HSF)作為逆境信號傳導(dǎo)通路中的重要成員，它能直接啟動下游防御基因(如熱激蛋白基因HSP、抗壞血酸過氧化物酶APX等)的轉(zhuǎn)錄表達，從而提高抗逆境的能力[6-9]．雖然，目前有研究[7-10]顯示，逆境誘導(dǎo)擬南芥熱激因子AtHsfA1a在防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7-10]．然而，不清楚熱激因子AtHsfA1a在逆境應(yīng)答途徑上游感應(yīng)哪些逆境信號，而進一步鑒定熱激因子響應(yīng)逆境的本質(zhì)與機理是研究的趨勢．大量研究[14-16]表明，植物細(xì)胞在逆境中反應(yīng)活性氧傷害程度的生理指標(biāo)丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)等濃度會發(fā)生變化，而降低逆境傷害的抗氧化酶系統(tǒng)也會積極參與，SOD、CAT、GR和APX等作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要成員，在逆境中通過活性的增加來執(zhí)行降低活性氧的生理功能使植物細(xì)胞受傷程度降到最低，從而提高植物抗逆性．但植物逆境中ABA與熱激因子AtHsfA1a協(xié)同對逆境生理指標(biāo)的影響研究較少．

為了研究ABA對擬南芥熱激因子AtHsfA1a在冷脅迫響應(yīng)中生理指標(biāo)的影響，本研究采用AtHsfA1a基因T-DNA插入的突變體及野生型的擬南芥幼苗為材料，在冷脅迫下分析ABA突變體及野生型植株的逆境生理生化指標(biāo)MDA、H202、SOD、CAT、GR和APX變化，同時探討擬南芥熱激因子AtHsfA1a在響應(yīng)冷脅迫中ABA的生理調(diào)控作用．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫下外源ABA和AtHsfA1a協(xié)同降低了MDA和H2O2濃度．進一步研究還發(fā)現(xiàn)，低溫下外源ABA和AtHsfA1a協(xié)同提高抗氧化酶活性降低低溫產(chǎn)生活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害而提高植物的抗冷性．研究[25]發(fā)現(xiàn)，在逆境中抗氧化酶活性高低與抗氧化酶的基因表達密切相關(guān)．此外，本項目申請者[26]也研究了在熱脅迫下AtHsfA1a對APX的表達調(diào)控作用．研究[11-13]顯示，在逆境中ABA能調(diào)控部分熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF的表達，但關(guān)于ABA與轉(zhuǎn)錄因子HSF如何從生理水平協(xié)同提高抗逆性研究較少，抗氧化酶基因的表達是否受 ABA和AtHsfA1a協(xié)同調(diào)控尚需進一步證實．