黃麗佳，吳雙鳳，鄧 亮，梁夢(mèng)潔，羅 娜，王 雪，郭亞?wèn)|，林彥君

(昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

煙草(NicotianatabacumL.)是茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiaria)植物，其在我國(guó)種植廣泛．在煙葉成熟和烘烤過(guò)程中，煙草中含有的豐富的氨基酸會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成一系列對(duì)烤煙品質(zhì)、香味和顏色有顯著影響的物質(zhì)[1]．因此，在烤煙栽培、烘烤、加工等過(guò)程中，測(cè)定其游離氨基酸的含量是一項(xiàng)很有意義的工作.

目前，煙草中氨基酸的測(cè)定一般采用液相色譜法[2-3]、氨基酸分析儀法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)[5-6]、離子色譜法[7]等，由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器昂貴，而氨基酸本身沒有紫外吸收，所以本文采用柱前衍生化法，通過(guò)衍生化反應(yīng)后，使用普通的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定了煙草中17種氨基酸的含量．

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料

乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸鈉(分析純，四川西隴科學(xué)有限公司)；17個(gè)氨基酸對(duì)照品(購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司，純度>98%)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水．

1.1.2 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(配置有二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和色譜工作站，美國(guó)Agilent公司)；AE240電子天平(精度 0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司)；超純水純化系統(tǒng)(Milli-Q50純水儀，美國(guó)Millipore公司)．

1.1.3 色譜條件

色譜柱為SunFire C18(4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm)；柱溫 40 ℃；流動(dòng)相流速1.0～1.5 mL/min；流動(dòng)相A：100 mmol/L 乙酸鈉；流動(dòng)相B：80%乙腈；梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.1.4 實(shí)驗(yàn)樣品

采自云南省石林縣耀奇香草谷的紅花大金元新鮮煙葉．

1.2 對(duì)照品溶液的制備

1)對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱定 0.010 0 g 天冬氨酸對(duì)照品，置于 10 mL 容量瓶中，加入一定量(0.1 mol/L)鹽酸水溶液，溶解后定容至 10 mL，得到 1 mg/mL 天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并裝入棕色瓶中，塞蓋密封，4 ℃ 條件下保存，備用．其余16種氨基酸(谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)對(duì)照品儲(chǔ)備液用上述方法制備．

2)對(duì)照品的衍生化過(guò)程：將對(duì)照品儲(chǔ)備液各取 1 mL 混勻后，準(zhǔn)確吸取 0.5 mL 混合對(duì)照品溶液，加入 0.5 mL 1 mol/L 三乙胺乙腈溶液(美國(guó)SIGMA-ALDRICH公司)，并加入 0.5 mL 0.1 mol/L 苯基異硫氰酸酯乙腈溶液(北京百靈威科技公司)，渦旋混勻 1 min，35 ℃ 水浴加熱反應(yīng) 0.5 h，待反應(yīng)完全后加入 1 mL 正己烷溶液，渦旋 1 min，靜置沉淀 15 min，取下層清液 200 μL 置于樣品瓶加入 800 μL 超純水，混勻 10 s，用 0.45 μm 有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾后，供液相色譜分析用．

1.3 樣品前處理及衍生

稱取煙葉粉末約 0.2 g，精密稱定，置于 15 mL 離心管，加入 5 mL 0.1 mol/L 鹽酸水溶液，超聲提取 40 min，8 000 r/min 離心 10 min，取上清液過(guò)濾以供備用．準(zhǔn)確移取 1 mL 過(guò)濾好的上清液，加入 1 mL 1 mol/L 三乙胺乙腈溶液，并加入 1 mL 0.1 mol/L 苯基異硫氰酸酯乙腈溶液，渦旋混勻 1 min，35 ℃ 水浴加熱反應(yīng) 0.5 h，待反應(yīng)完全后加入 2 mL 正己烷溶液，渦旋 1 min，靜置沉淀 15 min，取下層清液 200 μL 加入 800 μL 超純水，混勻 10 s，0.45 μm 有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾后置于樣品瓶，供液相色譜分析用．

2 結(jié)果與分析

將衍生化后的氨基酸對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)樣后在1.1.3色譜條件下分析，其HPLC色譜圖見圖1和圖2，17個(gè)氨基酸分離良好，峰型對(duì)稱．

圖1 17種氨基酸對(duì)照品色譜圖

圖2 17種氨基酸樣品色譜圖

2.1 線性關(guān)系考察

通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用選定色譜條件對(duì)17種氨基酸的系列對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，以氨基酸的峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，氨基酸的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)(X)，制作工作曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算當(dāng)信噪比S/N=3和S/N=10時(shí)所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表2．

表2 17種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表2可見，17種氨基酸在2.5～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(r>0.995),檢出限在0.010～0.017 μg/mL 之間，定量限在0.036～0.058 μg/mL 之間．

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次樣品6個(gè)，按1.3項(xiàng)下方法制備和衍生化反應(yīng)后，在1.1.3色譜條件下，準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品溶液 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄色譜峰面積，計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD值分別為：2.9%(Asp)，1.2%(Glu)，1.4%(Ser)，1.0%(Gly)，3.8%(His)，0.4%(Arg)，1.1%(Thr)，1.5%(Ala)，0.8%(Pro)，2.7%(Tyr)，2.3%(Val)，2.5%(Met)，1.8%(Cys)，1.7%(Ile)，0.7%(Leu)，2.0%(Phe)，2.9%(Lys)．結(jié)果顯示，所用測(cè)定方法的重復(fù)性良好．

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批次樣品6個(gè)，按1.3項(xiàng)下方法制備后，在1.1.3色譜條件下于 48 h 內(nèi)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD值分別為1.5%(Asp)，0.7%(Glu)，0.6%(Ser)，1.0%(Gly)，1.2%(His)，0.8%(Arg)，0.8%(Thr)，0.8%(Ala)，2.3%(Pro)，0.7%(Tyr)，0.7%(Val)，0.8%(Met)，1.1%(Cys)，0.6%(Ile)，2.7(Leu)，0.8%(Phe)，1.2%(Lys)，表明該實(shí)驗(yàn)方法在 48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好．

2.4 加標(biāo)回收率

在已經(jīng)測(cè)定了17種氨基酸含量的新鮮煙葉樣品中，按高、中、低 3 個(gè)質(zhì)量濃度水平添加一定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定9次，計(jì)算氨基酸的回收率．結(jié)果見表3．由表3可見，氨基酸在新鮮煙葉中的平均加標(biāo)回收率為：88.0%～99.6%，RSD為0.6%～3.5%.

2.5 樣品含量測(cè)定

取新鮮煙葉凍干粉，按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，在1.1.3色譜條件下進(jìn)樣分析，按回歸方程計(jì)算樣品中氨基酸的含量，其平均含量見表4.

表3 17種氨基酸的加標(biāo)回收率

表4 17種氨基酸的含量

3 討論

氨基酸是影響煙葉質(zhì)量和吸味的一類重要物質(zhì)，本文采用柱前衍生化后HPLC法同時(shí)測(cè)定新鮮煙葉中17種氨基酸的含量，該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性都很好，在設(shè)定的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r值大于0.995．回收率測(cè)定結(jié)果顯示，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要，17種氨基酸的總含量為 8.87 mg/g．