王育軍，李 強，譚 濤，王澤理，李 山，程昌新，王紹坤

(1.甘肅煙草工業(yè)有限責任公司 技術研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730050；2.湖南農業(yè)大學 煙草研究院，湖南 長沙 410128；3. 紅云紅河煙草(集團)有限責任公司，云南 昆明 650022)

有機酸廣泛存在于煙草中，一般為干物質量的12%～16%．煙葉有機酸不僅是卷煙風格特征和香氣質量的重要組成部分，還可以直接改變煙氣的酸堿平衡，影響卷煙的勁頭、刺激性和口感等[1-2]．王樹會等[3]研究不同品種及海拔對煙葉有機酸的影響，結果表明,紅大品種有機酸含量最高，K346品種次之，V2品種最低，總有機酸含量在海拔為 1 400～1 600 m 較高；許自成等[4]對烤煙鉀與多酚、有機酸及評吸品質的關系進行研究，結果顯示,鉀與有機酸總量變化規(guī)律相同，對香氣質和香氣量等評吸指標影響顯著；景延秋等[5]分析了NC89品種烤煙不同葉位葉片有機酸的差異，認為自下往上第10和12片葉有機酸適中，具有優(yōu)質原料的特質．以上研究對品種、海拔、葉位與烤煙有機酸的關系進行了探討，但尚缺乏系統(tǒng)性．根據烤煙八大香型劃分，西南高原生態(tài)區(qū)清甜香型以玉溪、昆明等地為典型產地[6-7]，而昆明市常年種植烤煙面積在 4.3×104hm2以上，是國內外卷煙工業(yè)企業(yè)爭搶的優(yōu)質原料產地[8]．鑒于此，本研究對昆明市烤煙有機酸特征及影響因素開展系統(tǒng)研究，以期為優(yōu)化西南高原生態(tài)區(qū)烤煙種植布局以及彰顯烤煙香氣質、香氣量提供科學依據．

1 材料與方法

1.1 烤煙樣品采集

2014—2016年，在昆明市4個植煙產地，以鄉(xiāng)鎮(zhèn)為單位，由昆明市專職煙葉分級技術人員依據《烤煙》(GB 2635—92)，采集當?shù)?個主栽品種的上部葉(B2F)、中部葉(C3F)、下部葉(X2F)初烤樣品480個，每個樣品取 2 kg．取樣點選擇當?shù)鼐哂写硇?，大田長相整齊，烤后葉片完整的煙葉．此外，利用GPS定位，記錄取樣點的海拔高度，具體取樣情況見表1．

表1 2014—2016年昆明煙區(qū)不同品種烤煙取樣統(tǒng)計

1.2 氣溫數(shù)據采集與計算

2015年在昆明市的上述4個植煙產地，利用DWJ1雙金屬自動記錄溫度儀(上海隆拓儀器設備有限公司)進行氣溫數(shù)據采集，其中，石林縣采集點在長湖鎮(zhèn)(海拔 1 902 m，103.41°E，24.68°N)，宜良縣在竹山鎮(zhèn)(海拔 1 850 m，103.08°E，24.40°N)，安寧市在八街鎮(zhèn)(海拔 1 951 m，102.20°E，24.42°N)，嵩明縣在滇源鎮(zhèn)(海拔 2 086 m，102.50°E，25.15°N)．并采用 24 h 平均法進行日均溫計算，統(tǒng)計3—9月各月平均氣溫，并以白天溫度最高值與夜間溫度最低值之差為日晝夜溫差，統(tǒng)計3—9月各月平均晝夜溫差，氣溫統(tǒng)計見表2．

表2 2015年昆明植煙區(qū)氣溫統(tǒng)計

1.3 有機酸測定指標與方法

煙葉有機酸測定指標包括不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸)、飽和脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸)、非揮發(fā)有機酸(草酸、檸檬酸、丙二酸、蘋果酸)．方法采用氣相色譜法[9-10]：從 2 kg 樣品中隨機抽取20片葉，去除主脈，在 60 ℃ 恒溫箱中烘干，粉碎過 0.15 mm 篩，密封保存在 -15 ℃ 環(huán)境下．準確稱取處理后的樣品 0.5 g，置于 100 mL 干燥三角瓶內，加入 25 mL 10%硫酸-甲醇溶液和戊二酸-甲醇溶液，搖勻，室溫條件下震蕩 24 h，過濾并置于分液漏斗中，然后用二氯甲烷萃?。畬o水硫酸鈉加入到萃取液中除去水分，取 1 μL 注入氣相色譜儀，采用內標法定量檢測．分析儀器為美國Finingan公司的GC-Trace Ultra，AI3000自動液體進樣器，F(xiàn)ID檢測器，DB-5石英毛細管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，載氣為氮氣，F(xiàn)ID檢測器和氣化室溫度為 250 ℃，分流比10∶1，程序升溫：初溫 40 ℃，保持 1 min，以 10 ℃/min 升溫至 150 ℃，再以 15 ℃/min 升溫至 280 ℃[11]．

1.4 數(shù)據處理與分析

利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行方差分析和典型相關分析．

2 結果與分析

2.1 烤煙有機酸總體特征

由表3可知，昆明烤煙有機酸平均值為 52.63 mg/g，變化幅度為35.31～121.78 mg/g，變異系數(shù)為32.37%．其中：飽和脂肪酸含量變異較大，變異系數(shù)在68.75%～100.40%之間，說明飽和脂肪酸含量的穩(wěn)定性較差；非揮發(fā)多元有機酸和不飽和脂肪酸變異系數(shù)均在50%以內，穩(wěn)定性相對較好．不同種類有機酸以非揮發(fā)多元有機酸含量最高，不飽和脂肪酸次之，飽和脂肪酸最低．其中：非揮發(fā)多元有機酸以蘋果酸和草酸的含量較高，檸檬酸和丙二酸較低；不飽和脂肪酸以油酸為主，含量為 13.04 mg/g，而亞油酸含量僅為 1.58 mg/g；飽和脂肪酸以肉豆蔻酸含量最高，棕櫚酸含量次之，月桂酸和硬脂酸的含量較低．

表3 昆明煙區(qū)烤煙有機酸描述統(tǒng)計分析

2.2 不同產地間烤煙有機酸特征

從表4可以看出，昆明部分煙區(qū)不同產地間烤煙棕櫚酸、月桂酸含量和有機酸總量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，丙二酸、檸檬酸、肉豆蔻酸、亞油酸含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，草酸、蘋果酸、硬脂酸、油酸含量差異無統(tǒng)計學意義．而月桂酸含量以安寧市最高，宜良縣次之，嵩明縣最低；棕櫚酸含量以石林縣最低，極顯著低于其他產地；有機酸總量以宜良縣和安寧市較高，這兩地間差異無統(tǒng)計學意義，但均極顯著高于嵩明縣和石林縣．丙二酸含量由高到低依次為w(宜良縣)>w(石林縣)>w(安寧市)>w(嵩明縣)，檸檬酸含量表現(xiàn)為w(安寧市)>w(宜良縣)>w(嵩明縣)>w(石林縣)，肉豆蔻酸和亞油酸的含量表現(xiàn)為w(宜良縣)>w(嵩明縣)>w(安寧市)>w(石林縣)．

表4 不同產地間烤煙有機酸差異分析 mg/g

2.3 不同品種間烤煙有機酸特征

從表5看出，月桂酸含量和有機酸總量在不同品種間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，草酸、丙二酸、蘋果酸含量在不同品種間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而檸檬酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、亞油酸、油酸含量在品種間差異無統(tǒng)計學意義．不同品種烤煙有機酸總量以K326最高，極顯著高于其他品種，表現(xiàn)為w(K326)>w(NC102)>w(紅大)>w(NC297)>w(云煙87)．月桂酸含量以NC102最高，K326次之，NC297最低；草酸含量以K326最高，NC102次之，紅大最低；丙二酸含量以K326最高，紅大次之，NC297最低；蘋果酸含量以K326最高，NC297次之，云煙87最低．

2.4 不同部位間烤煙有機酸特征

由表6可知，不同部位間烤煙蘋果酸、硬脂酸、亞油酸含量和有機酸總量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而其他有機酸含量差異無統(tǒng)計學意義．且蘋果酸、硬脂酸、亞油酸含量和有機酸總量均以上部葉(B2F)為最高，在不同部位間有機酸總量由高到低順序依次為w(上部葉)>w(中部葉)>w(下部葉)．

表5 不同品種間烤煙有機酸差異分析 mg/g

表6 不同部位間烤煙有機酸差異分析 mg/g

2.5 氣溫對烤煙有機酸的影響

將氣溫作為一組變量，并分成月平均氣溫和月平均晝夜溫差2個變量組，而將有機酸作為另一組變量，兩組變量進行典型相關分析[12]．由表7可知，月平均氣溫與煙葉有機酸的1～4對典型變量均無統(tǒng)計學意義．月平均晝夜溫差與有機酸的第1對典型變量有統(tǒng)計學意義，而與第2～4對典型變量無統(tǒng)計學意義，因此，對月平均晝夜溫差與有機酸的關系進一步分析．

將各月平均晝夜溫差與各樣品有機酸數(shù)據標準化，進行典型相關分析，求出典型變量系數(shù)(mi)及原始變量與典型變量的相關系數(shù)(rui)，結果列于表8．由表8可知，月平均晝夜溫差與有機酸的第1對典型變量構成(1)和(2)式．

U1=-0.853 7X1-0.102 6X2-1.802 1X3+0.561 2X4+1.066 2X5-1.489 6X6+0.165 1X7；

(1)

V1=-0.825 8Y1+1.265 9Y2-0.290 2Y3-0.206 9Y4+0.876 8Y5+0.920 6Y6+1.324 9Y7-0.810 2Y8+1.374 8Y9-0.210 5Y10+0.786 3Y11．

(2)

表7 氣溫與烤煙有機酸的典型相關系數(shù)

表8 平均晝夜溫差與烤煙有機酸的顯著典型變量構成

(1)和(2)式中U1和V1分別表示晝夜溫差與有機酸的典型變量.由U1與晝夜溫差原始數(shù)據相關系數(shù)可知，它與5月、8月和9月平均晝夜溫差均呈極顯著或顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.689**、-0.823**和-0.483*，表明5月、8月和9月晝夜溫差對煙葉有機酸積累起決定性作用．V1與蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量的原始數(shù)據均呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.886**、0.795**和0.682**．因此，U1描述了5月、8月、9月平均晝夜溫差的綜合性狀，V1描述了煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量的綜合性狀．由上述分析可知，昆明部分煙區(qū)5月、8月和9月平均晝夜溫差與烤后煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量密切相關，平均晝夜溫差的影響由大到小分別為8月、5月、9月，平均晝夜溫差對煙葉有機酸的影響大小依次為蘋果酸、檸檬酸、有機酸總量．隨著烤煙大田期5月、8月和9月平均晝夜溫差增加，會顯著或極顯著引起煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量的降低．

2.6 海拔對烤煙有機酸的影響

將海拔以 200 m 組距分為4組，由表9可知，各海拔組間有機酸總量差異有統(tǒng)計學意義，有機酸總量隨海拔上升表現(xiàn)為先升高后降低，其含量在 1 800～2 000 m 海拔段達到最高，而以 1 400～1 600 m 海拔段為最低．檸檬酸和月桂酸含量在不同海拔段間差異有統(tǒng)計學意義，檸檬酸含量的變化規(guī)律與有機酸總量一致；月桂酸含量隨海拔升高而逐漸升高，其含量以 2 000～2 200 m 海拔段最高．肉豆蔻酸、硬脂酸和油酸含量在不同海拔段差異有統(tǒng)計學意義，肉蔻豆酸和油酸含量變化規(guī)律與有機酸總量一樣；硬脂酸含量在 1 400～1 600 m 海拔段時最高，顯著高于其他海拔段，而以 1 600～1 800 m 海拔段為最低．

表9 不同海拔高度間烤煙有機酸差異分析 mg/g

3 討論與結論

煙草中有機酸大多是碳水化合物代謝的中間產物，同時又是氨基酸和其他有機化合物合成的前體物．此外，許多有機酸及其衍生物還是煙草香味的主要成分．有機酸不僅對煙草新陳代謝有重要作用，還能改善抽吸質量．而生態(tài)條件、品種和栽培技術都是影響煙葉有機酸的重要因素[13]．

本研究表明，昆明部分烤煙有機酸平均值為 52.63 mg/g，有機酸含量豐富，不同種類有機酸表現(xiàn)為w(非揮發(fā)多元有機酸)>w(不飽和脂肪酸)>w(飽和脂肪酸)；非揮發(fā)多元有機酸表現(xiàn)為w(蘋果酸)>w(草酸)>w(檸檬酸)>w(丙二酸)，不飽和脂肪酸為w(油酸)>w(亞油酸)，飽和脂肪酸為w(肉豆蔻酸)>w(棕櫚酸)>w(月桂酸)>w(硬脂酸)；不同產地有機酸總量表現(xiàn)為w(宜良縣)>w(安寧市)>w(嵩明縣)>w(石林縣)，產地間差異有統(tǒng)計學意義，這可能是不同產地生態(tài)條件綜合作用的結果；不同品種有機酸總量差異有統(tǒng)計學意義，有機酸總量為w(K326)>w(NC102)>w(紅大)>w(NC297)>w(云煙87)，結果與西南高原生態(tài)區(qū)K326和紅大品種香氣物質含量高、致香效果好一致[8，14]；不同部位間烤煙有機酸總量差異有統(tǒng)計學意義，有機酸總量表現(xiàn)為w(上部葉)>w(中部葉)>w(下部葉)．

種植海拔對檸檬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸和油酸影響極顯著或顯著，有機酸總量隨海拔升高表現(xiàn)為先增加后降低，不同海拔段有機酸總量由高到低順序依次為 1 800～2 000 m、2 000～2 200 m、1 600～1 800 m、1 400～1 600 m．3—9月的月平均氣溫對有機酸影響不顯著，而5月、8月和9月的月平均晝夜溫差對蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量影響顯著，隨著5月、8月和9月平均晝夜溫差增加，煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量極顯著降低，這可能是由于昆明3—9月白天整體溫度較高，夜間溫度雖然較低，但整體月平均氣溫能夠滿足烤煙生長對溫度的需求，而5月正處于烤煙移栽期，5月夜間低溫會影響烤煙的生根還苗，8—9月正處于烤煙旺長成熟期，夜間低溫通過影響烤煙新陳代謝來影響有機酸的合成積累．因此，5月、8月、9月平均晝夜溫差對煙葉蘋果酸、檸檬酸和有機酸總量影響極顯著，這與楊虹琦等[15]認為烤煙中對生態(tài)因素反應最敏感的是草酸、檸檬酸和蘋果酸的結論基本一致．