劉興賦，郁林娜，付洋，程盛勇，魯文琴，羅喜榮，楊軍

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550004；3.中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550081）

橘核為我國(guó)常用中藥，系蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟種子，具有理氣、散結(jié)、止痛等功效[1]。橘核的主要活性成分為檸檬苦素類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，具有明顯的抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、殺蟲(chóng)等藥理作用，現(xiàn)代臨床常用于治療急性乳腺炎、乳腺增生等疾病，其藥用價(jià)值較高[2-8]。橘核目前仍以理化鑒別為質(zhì)量控制手段，缺少含量測(cè)定項(xiàng)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。依據(jù)中藥整體成分發(fā)揮作用的特點(diǎn)，開(kāi)展指紋圖譜研究和多成分含量測(cè)定并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是保障中藥質(zhì)量和療效一致性的有效方法。本試驗(yàn)基于前期橘核超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatograph，UPLC）指紋圖譜研究[9]，首次建立了UPLC 同時(shí)測(cè)定橘核中柚皮素、橙皮素、柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林和黃柏酮含量的方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和修訂提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

柑橘果實(shí)收集于貴州、湖南、廣西等地，果實(shí)摘取種子，洗凈后自然陰干，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室覃容貴教授鑒定為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥種子，見(jiàn)表1。

表1 橘核樣品來(lái)源Table 1 Citri reticulatae semen samples from different production batches and areas

柚皮素、柚皮苷、黃柏酮對(duì)照品：北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為1112A024，116A022，516A21，純度均＞98%；橙皮素對(duì)照品：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)130429，純度＞98%；橙皮苷對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110721-201014，純度＞95 %；檸檬苦素、諾米林對(duì)照品：實(shí)驗(yàn)室自制，純度均＞98%；乙腈（色譜純）：德國(guó)默克公司。

1.1.2 儀器

Agilent 1290 DAD 超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；BSA224S 型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UC-10H 型加熱超聲波清洗器：上海泰坦科技股份有限公司；TGL-16G 型高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FW177 型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：UItimateRUHPLC Polar-AQ-C18（2.1 nm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（45 ∶55，體積比）；梯度洗脫（0～18 min，15%～40%A；18 min～20 min，40%A；20 min～35 min，40%～50%A）；流速：0.21 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm（0～20 min），210 nm（20 min～35 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：0.8 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品適量置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為400、375、112.5、262.5、8 037.5、1 400、1 500 mg/L 的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取脫脂橘核粉末（過(guò)40 目篩）0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取（功率 200 W，頻率 35 kHz）40 min，放至室溫20 ℃，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋得系列混合對(duì)照品工作溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以混合對(duì)照品溶液中各指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD 值。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批次橘核藥材6 份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD 值。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取6 份已知含量的橘核藥材粉末0.1 g，分別加入混合對(duì)照品溶液適量，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的平均回收率和RSD 值。

1.2.9 樣品測(cè)定與數(shù)據(jù)處理

取表1 樣品按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的峰面積，以回歸方程計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液按“1.2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果7 種被測(cè)成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，峰形較好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and sample（B）

表2 7 種成分回歸方程及線(xiàn)性范圍Table 2 Regression equations with linear range for 7 compounds

2.3 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD 分別為1.74%、1.89%、1.87%、1.28%、1.91%、1.65%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD 分別為1.96%、1.83%、1.93%、1.77%、1.75%、1.97%、1.29%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD 分別為1.54%、1.15%、1.68%、1.89%、1.36%、1.79%、1.61%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的平均回收率分別為 102.93 %、108.84 %、109.18 %、106.97 %、102.62 %、103.98 %、103.19 %，RSD 分別為 1.96 %、1.82%、1.45%、1.71%、1.67%、0.86%、1.16%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品測(cè)定

取表1 樣品按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3 和圖2。

表3 橘核中7 種成分的含量測(cè)定Table 3 Determination of seven components in Citri reticulatae semen %

圖2 橘核中7 種成分含量分布Fig.2 Distribution of seven components in Citri reticulatae semen

3 結(jié)論

本試驗(yàn)考察了水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、95 %乙醇、無(wú)水乙醇等提取溶劑對(duì)橘核中7 種成分提取的影響，結(jié)果表明甲醇提取效果最佳。采用DAD 檢測(cè)器對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)成分的最大吸收波長(zhǎng)為283 nm，檸檬苦素類(lèi)成分吸收峰在210 nm 處響應(yīng)最高，故采用波長(zhǎng)切換法對(duì)橘核樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2017 年我國(guó)柑橘總產(chǎn)量高達(dá)3 816 萬(wàn)噸，品種品系眾多，橘核來(lái)源豐富[10]。中國(guó)藥典2015 年版中橘核藥材無(wú)含量測(cè)定方法及限度要求，已不適應(yīng)橘核的現(xiàn)代應(yīng)用要求。本研究建立了UPLC 同時(shí)測(cè)定橘核中柚皮素、橙皮素、柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林和黃柏酮含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于橘核藥材的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。樣品測(cè)定結(jié)果表明16 批不同產(chǎn)地橘核藥材中7 種成分含量差異較大，RSD 為32.98%～124.16%，其中檸檬苦素和諾米林分別占總量的65.32%和24.63%，為保證橘核藥材的臨床療效，建議橘核中檸檬苦素含量不得少于0.71%、諾米林含量不得少于0.27%、7 種成分含量不得少于1.09%。